Evaluación de los efectos inmunológicos de nuevos componentes de alto valor biológico elaborados por la industria alimentaria
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Alché Ramírez, VíctorEditorial
Universidad de Granada
Departamento
Universidad de Granada. Programa de Doctorado en Medicina Clínica y Salud PúblicaMateria
Antiinflammatory Antioxidants ß-conglutins Biomarkers Diabetes Induction Inflammation Insulin Legumes Olive Oxidation Pancreatic cells Resistances Seeds Vicilin
Date
2021Fecha lectura
2021-04-07Referencia bibliográfica
Alché Ramírez, Víctor. Evaluación de los efectos inmunológicos de nuevos componentes de alto valor biológico elaborados por la industria alimentaria. Granada: Universidad de Granada, 2021. [http://hdl.handle.net/10481/68000]
Sponsorship
Tesis Univ. Granada.; P2010- AGR6274 P2011-CVI-7487, CA8313, P18-RT-1577 (Junta de Andalucía); RTC-2015-4181- 2; RTC-2016-4824-2; RTC-2017-6654-2 (Programa Retos-Colaboración); 201540E065/ 09021200008 (Proyecto intramural/contrato apoyo tecnológico CSIC); BFU-2016- 77243-P (Plan Nacional I+D); MARIE CURIE (FP7-PEOPLE-24 2011-IOF) a través de las ayudas PIOF-GA-2011-301550; RYC-2014- 16536 (Programa de Investigación Ramón y Cajal, Ministerio de Economía, Industria y Competitividad)Abstract
Human and animal feeding is continuously needed of new alimentary sources both healthy and highly
productive, in order to accommodate increasing demographic pressure and strong demand of
specialized foods. Apart from the regular primary agro-food sources, the design of alternative ways
for raw foods processing, re-usage of secondary products or by-products, or the isolation of essential
components from foods and their addition to functional or dedicated design-foods represent
strategies of wide evolution.
The present work focuses into the alternative usage of two basic food resources. On one side, olive
fractionation prior to olive processing in the oil factories is a source or new and valuable products of
high added value. One of these products is the flour arising from the olive stone, which is becoming
highly valuated because of its high content in nutritional components and its emerging nutraceutical
capacities. On the other side, the different species of sweet lupins, particularly narrowleafed lupin,
represent crops in continuous growth, as its consumption in several preparations (i.e. whole seeds
or flours) have shown to display anti-diabetic properties, as well as a satiating property contributing
to fight obesity. We lack, however of scientific evidence supporting such properties, which were
observed empirically only. Therefore, the main objective of the present Ph.D. work is to obtain such
evidence, through the biological assay of components derived from these alimentary sources.
In the case of the olive, the NUTRAOLEUM study was used as the basis. This study has shown to be a
highly informative scenario to analyze in vivo the benefits of triterpenes of the olive oil (oleanolic and
maslinic acids) on the health of healthy humans. The assay encompasses the raw intake by
participants of a supplementary dose (30 mL/day) of optimized olive oil, and a functional olive oil,
both created by means of olive-derived-technical procedures, in comparison with intake of an extravirgin olive oil (all of them displaying differential concentrations of these compounds). Fifty-one
adults participated in this random, crossed, controlled assay. Differently from other studies emerging
from this clinical assay already performed in vivo, in this Ph. D. work a new method for ex vivo culture
of the patients’ blood including the induction of an artificial inflammatory state was designed, which
allowed the amplification of the signaling network involved. The plasma samples, or the peripheral
mononuclear blood cells isolated from the cultures were subjected to a comprehensive analysis of
inflammation and oxidative stress by means of ELISA, Q-PCR, quantitative Western blotting and BioPlex [i.e. IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12, IL-13, IL-17, granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF), interferon (IFN)-γ, TNF-α, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF),
macrophage inflammatory protein (MIP)-1β, monocyte chemotactic protein (MCP)-1], NO
concentration, presence of iNOS and changes in the protein nitration profiles), which allowed
demonstrating the high anti-inflammatory and anti-oxidant capacity of these compounds
(triterpenes) from the olive oil. It was also shown (by using analogous procedures) the antiinflammatory character of flours derived from olive seeds, which were added to the ex vivo blood
cultures of the patients. This was particularly evident in the type-2 diabetic patients, who showed a
diminution of the sub-clinic inflammatory state, subjacent to this pathology. Such assays with seed
flours were also confirmed in a different experimental system, which consist in cell cultures of
pancreatic cells, induced by using three different inflammation inducers.
In the case of lupin proteins, recombinant forms of the narrowleafed (rβ1, rβ2, rβ3, rβ4 y rβ6),
purified by affinity chromatography were used. These proteins were assayed in several biological
systems including their ex vivo co-culture with the blood of healthy patients and diabetic/metabolic
syndrome patients, in vitro culture of pancreatic cells, and in vitro cultures of pancreatic cells after
the induction of insulin tolerance. In this case, on top of the most relevant markers of inflammation
and oxidative state mentioned above, additional markers were used, as those corresponding to protein carbonylation, markers involved in the insulin signaling pathways and others like IRS-1, GLUT4, CCL5, CCR2, ICAM-1 and NF-κB1 (p50), protein kinase B (AKT). Also, analyses regarding the
straightforward capacity of the recombinant conglutins to bind insulin and an analysis of IRS-1
phosphorylation were performed. Such studies concluded that rβ1, rβ3, y rβ6 conglutins are able to
reduce the expression of pro-inflammatory molecules as well as the whole oxidative state, increasing
on the other side the expression of insulin receptors and transporters, possibly favoring recognition
and control of the insulin levels. rβ2 y rβ4 isoforms of conglutins are, contrarily, favoring the
inflammatory state and had no effect insulin signaling. In the case of insulin-resistant cells, the
recombinant conglutins rβ1, rβ3, y rβ6 were able to noticeably improve the levels of the most
relevant markers involved in maintaining optimal inflammatory and oxidative state in the resistant
cultures.
The present Ph. D. allowed to develop tools and procedures able to dissect the potential nutraceutical
effects of different food components, by exemplifying them in two foods of broad use like the olive
(and its derivatives) and lupin. This knowledge will be of utility for the agro-food industry and
develops new aspects of health, which are likely applicable to the treatment of several pathologies
like type-2 diabetes. La alimentación humana y animal están continuamente necesitadas de nuevas fuentes alimentarias
saludables y altamente productivas para dar cabida a la creciente presión demográfica y a la fuerte
demanda de alimentos especializados. Aparte de las fuentes agroalimentarias primarias habituales,
el diseño de vías alternativas de procesamiento de estos alimentos basales, la reutilización de
productos secundarios o subproductos, o el aislamiento de componentes esenciales de los alimentos
y su adición a alimentos funcionales o de diseño son estrategias en amplia evolución.
El presente trabajo se centra en la utilización alternativa de dos recursos alimentarios básicos. Por
una parte, el fraccionamiento de la aceituna de forma previa a su procesado en las almazaras es una
fuente de nuevos y valiosos productos con alto valor añadido. Uno de estos productos son las harinas
procedentes de la semilla del hueso, que están siendo valoradas por su alto contenido en
componentes nutricionales y por sus emergentes capacidades nutracéuticas. Por otra parte, las
diversas especies de altramuz dulce, y especialmente el altramuz de hoja estrecha, representan
cultivos en continuo crecimiento dado que su consumo en diversas preparaciones (ej. semillas
completas o harinas) ha mostrado poseer propiedades antidiabéticas, así como propiedades
saciantes que contribuyen a luchar contra la obesidad. Carecemos, sin embargo, de evidencias
científicas que soporten estas propiedades observadas de forma empírica. Es por tanto el objetivo
fundamental de esta Tesis Doctoral obtener dicha evidencia, a través del ensayo biológico de
componentes derivados de estas fuentes alimentarias.
En el caso de la aceituna, se ha tomado como base el estudio NUTRAOLEUM, que ha mostrado ser
un escenario altamente informativo para analizar in vivo los beneficios de los triterpenos del aceite
de oliva (ácidos oleanólico y maslínico) sobre la salud de humanos sanos. El ensayo incorpora la toma
basal por parte de los participantes de un suplemento diario (30 mL/día) de aceite optimizado de
aceite de oliva, y de un aceite de oliva funcional, ambos creados mediante procedimientos de
elaiotecnia, en comparación con la toma de un aceite de oliva virgen extra (todos ellos con
concentraciones diferenciales de estos compuestos). En el ensayo (aleatorizado, cruzado y
controlado) participaron 51 adultos. A diferencia de otros estudios emergentes de este ensayo clínico
ya realizados in vivo, en esta Tesis Doctoral se optimizó un método de cultivo ex vivo de la sangre de
los pacientes con inducción de un estado inflamatorio artificial que permitió una amplificación de la
red de señales implicadas. Las muestras de plasma obtenidas o las células mononucleares de sangre
periférica aisladas de los cultivos fueron sometidas a un exhaustivo análisis de marcadores de
inflamación y estrés oxidativo mediante ELISA, Q-PCR, Western blotting cuantitativo y Bio-Plex [i.e.
IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12, IL-13, IL-17, granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF), interferon (IFN)-γ, TNF-α, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF),
macrophage inflammatory protein (MIP)-1β, monocyte chemotactic protein (MCP)-1], concentración
de NO, presencia de iNOS y cambios en los patrones de nitración proteica), que permitieron
demostrar la elevada capacidad antiinflamatoria y antioxidante de estos compuestos (triterpenos)
del aceite de oliva. Igualmente se demostró (por procedimientos análogos), el carácter
antiinflamatorio de las harinas derivadas de semillas de olivo que fueron añadidas a los cultivos ex
vivo de sangre de pacientes, y que fue especialmente evidente en pacientes diabéticos tipo 2 en los
cuales se detectó una disminución de la inflamación subclínica subyacente a esta patología. Estos
ensayos con harinas de semillas fueron además confirmados en otro sistema experimental,
consistente en experimentos en cultivos celulares de células pancreáticas, inducidos con tres
inductores diferenciales de inflamación En el caso de las proteínas de altramuz, se utilizaron las formas recombinantes (rβ1, rβ2, rβ3, rβ4 y
rβ6) de las conglutinas del altramuz de hoja estrecha, purificadas mediante cromatografía de
afinidad. Estas proteínas fueron ensayadas en diversos sistemas biológicos que incluyen su co-cultivo
ex vivo con sangres de pacientes sanos y diabéticos/síndrome metabólico, cultivos in vitro de células
pancreáticas, y cultivos in vitro de células pancreáticas en las que se había inducido tolerancia a
insulina. En este caso, además de los marcadores de inflamación y del estado oxidativo más
relevantes mencionados anteriormente, se analizaron marcadores adicionales como la carbonilación
proteica, y marcadores implicados en la ruta de señalización de la insulina y otros, como IRS-1, GLUT4, CCL5, CCR2, ICAM-1 y NF-κB1 (p50), proteína kinasa B (AKT). También se realizaron análisis de la
capacidad de unión directa de estas conglutinas recombinantes con la insulina y un análisis de la
fosforilación de IRS-1. Estos estudios concluyeron que las conglutinas rβ1, rβ3, y rβ6 son capaces de
reducir la expresión y la presencia de moléculas proinflamatorias y el estado oxidativo en general, e
incrementar por otra parte la expresión de receptores y transportadores de la insulina, favoreciendo
posiblemente el reconocimiento y el control de los niveles de ésta. Las isoformas rβ2 y rβ4 son, por
el contrario, favorecedoras de un estado inflamatorio y no tuvieron efecto sobre la señalización de
la insulina. En el caso de células resistentes a la insulina, las conglutinas recombinantes rβ1, rβ3, y
rβ6 fueron capaces de mejorar notablemente los niveles de los marcadores más relevantes
referentes a inflamación y estado oxidativo de los cultivos resistentes.
Esta Tesis Doctoral ha permitido, por tanto, desarrollar herramientas y procedimientos capaces de
diseccionar los efectos potencialmente nutracéuticos de diferentes componentes agroalimentarios,
ejemplificándolos en el caso de dos alimentos de amplia utilización como son la aceituna (y sus
derivados) y el altramuz. Este conocimiento es de utilidad para la industria agroalimentaria y
desarrolla nuevos aspectos de la salud, probablemente aplicables al tratamiento de diversas
patologías como la diabetes tipo 2.