Evaluación de los efectos inmunológicos de nuevos componentes de alto valor biológico elaborados por la industria alimentaria Alché Ramírez, Víctor Alché Ramírez, Juan de Dios Lima-Cabello, Elena Universidad de Granada. Programa de Doctorado en Medicina Clínica y Salud Pública Antiinflammatory Antioxidants ß-conglutins Biomarkers Diabetes Induction Inflammation Insulin Legumes Olive Oxidation Pancreatic cells Resistances Seeds Vicilin Human and animal feeding is continuously needed of new alimentary sources both healthy and highly productive, in order to accommodate increasing demographic pressure and strong demand of specialized foods. Apart from the regular primary agro-food sources, the design of alternative ways for raw foods processing, re-usage of secondary products or by-products, or the isolation of essential components from foods and their addition to functional or dedicated design-foods represent strategies of wide evolution. The present work focuses into the alternative usage of two basic food resources. On one side, olive fractionation prior to olive processing in the oil factories is a source or new and valuable products of high added value. One of these products is the flour arising from the olive stone, which is becoming highly valuated because of its high content in nutritional components and its emerging nutraceutical capacities. On the other side, the different species of sweet lupins, particularly narrowleafed lupin, represent crops in continuous growth, as its consumption in several preparations (i.e. whole seeds or flours) have shown to display anti-diabetic properties, as well as a satiating property contributing to fight obesity. We lack, however of scientific evidence supporting such properties, which were observed empirically only. Therefore, the main objective of the present Ph.D. work is to obtain such evidence, through the biological assay of components derived from these alimentary sources. In the case of the olive, the NUTRAOLEUM study was used as the basis. This study has shown to be a highly informative scenario to analyze in vivo the benefits of triterpenes of the olive oil (oleanolic and maslinic acids) on the health of healthy humans. The assay encompasses the raw intake by participants of a supplementary dose (30 mL/day) of optimized olive oil, and a functional olive oil, both created by means of olive-derived-technical procedures, in comparison with intake of an extravirgin olive oil (all of them displaying differential concentrations of these compounds). Fifty-one adults participated in this random, crossed, controlled assay. Differently from other studies emerging from this clinical assay already performed in vivo, in this Ph. D. work a new method for ex vivo culture of the patients’ blood including the induction of an artificial inflammatory state was designed, which allowed the amplification of the signaling network involved. The plasma samples, or the peripheral mononuclear blood cells isolated from the cultures were subjected to a comprehensive analysis of inflammation and oxidative stress by means of ELISA, Q-PCR, quantitative Western blotting and BioPlex [i.e. IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12, IL-13, IL-17, granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF), interferon (IFN)-γ, TNF-α, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), macrophage inflammatory protein (MIP)-1β, monocyte chemotactic protein (MCP)-1], NO concentration, presence of iNOS and changes in the protein nitration profiles), which allowed demonstrating the high anti-inflammatory and anti-oxidant capacity of these compounds (triterpenes) from the olive oil. It was also shown (by using analogous procedures) the antiinflammatory character of flours derived from olive seeds, which were added to the ex vivo blood cultures of the patients. This was particularly evident in the type-2 diabetic patients, who showed a diminution of the sub-clinic inflammatory state, subjacent to this pathology. Such assays with seed flours were also confirmed in a different experimental system, which consist in cell cultures of pancreatic cells, induced by using three different inflammation inducers. In the case of lupin proteins, recombinant forms of the narrowleafed (rβ1, rβ2, rβ3, rβ4 y rβ6), purified by affinity chromatography were used. These proteins were assayed in several biological systems including their ex vivo co-culture with the blood of healthy patients and diabetic/metabolic syndrome patients, in vitro culture of pancreatic cells, and in vitro cultures of pancreatic cells after the induction of insulin tolerance. In this case, on top of the most relevant markers of inflammation and oxidative state mentioned above, additional markers were used, as those corresponding to protein carbonylation, markers involved in the insulin signaling pathways and others like IRS-1, GLUT4, CCL5, CCR2, ICAM-1 and NF-κB1 (p50), protein kinase B (AKT). Also, analyses regarding the straightforward capacity of the recombinant conglutins to bind insulin and an analysis of IRS-1 phosphorylation were performed. Such studies concluded that rβ1, rβ3, y rβ6 conglutins are able to reduce the expression of pro-inflammatory molecules as well as the whole oxidative state, increasing on the other side the expression of insulin receptors and transporters, possibly favoring recognition and control of the insulin levels. rβ2 y rβ4 isoforms of conglutins are, contrarily, favoring the inflammatory state and had no effect insulin signaling. In the case of insulin-resistant cells, the recombinant conglutins rβ1, rβ3, y rβ6 were able to noticeably improve the levels of the most relevant markers involved in maintaining optimal inflammatory and oxidative state in the resistant cultures. The present Ph. D. allowed to develop tools and procedures able to dissect the potential nutraceutical effects of different food components, by exemplifying them in two foods of broad use like the olive (and its derivatives) and lupin. This knowledge will be of utility for the agro-food industry and develops new aspects of health, which are likely applicable to the treatment of several pathologies like type-2 diabetes. La alimentación humana y animal están continuamente necesitadas de nuevas fuentes alimentarias saludables y altamente productivas para dar cabida a la creciente presión demográfica y a la fuerte demanda de alimentos especializados. Aparte de las fuentes agroalimentarias primarias habituales, el diseño de vías alternativas de procesamiento de estos alimentos basales, la reutilización de productos secundarios o subproductos, o el aislamiento de componentes esenciales de los alimentos y su adición a alimentos funcionales o de diseño son estrategias en amplia evolución. El presente trabajo se centra en la utilización alternativa de dos recursos alimentarios básicos. Por una parte, el fraccionamiento de la aceituna de forma previa a su procesado en las almazaras es una fuente de nuevos y valiosos productos con alto valor añadido. Uno de estos productos son las harinas procedentes de la semilla del hueso, que están siendo valoradas por su alto contenido en componentes nutricionales y por sus emergentes capacidades nutracéuticas. Por otra parte, las diversas especies de altramuz dulce, y especialmente el altramuz de hoja estrecha, representan cultivos en continuo crecimiento dado que su consumo en diversas preparaciones (ej. semillas completas o harinas) ha mostrado poseer propiedades antidiabéticas, así como propiedades saciantes que contribuyen a luchar contra la obesidad. Carecemos, sin embargo, de evidencias científicas que soporten estas propiedades observadas de forma empírica. Es por tanto el objetivo fundamental de esta Tesis Doctoral obtener dicha evidencia, a través del ensayo biológico de componentes derivados de estas fuentes alimentarias. En el caso de la aceituna, se ha tomado como base el estudio NUTRAOLEUM, que ha mostrado ser un escenario altamente informativo para analizar in vivo los beneficios de los triterpenos del aceite de oliva (ácidos oleanólico y maslínico) sobre la salud de humanos sanos. El ensayo incorpora la toma basal por parte de los participantes de un suplemento diario (30 mL/día) de aceite optimizado de aceite de oliva, y de un aceite de oliva funcional, ambos creados mediante procedimientos de elaiotecnia, en comparación con la toma de un aceite de oliva virgen extra (todos ellos con concentraciones diferenciales de estos compuestos). En el ensayo (aleatorizado, cruzado y controlado) participaron 51 adultos. A diferencia de otros estudios emergentes de este ensayo clínico ya realizados in vivo, en esta Tesis Doctoral se optimizó un método de cultivo ex vivo de la sangre de los pacientes con inducción de un estado inflamatorio artificial que permitió una amplificación de la red de señales implicadas. Las muestras de plasma obtenidas o las células mononucleares de sangre periférica aisladas de los cultivos fueron sometidas a un exhaustivo análisis de marcadores de inflamación y estrés oxidativo mediante ELISA, Q-PCR, Western blotting cuantitativo y Bio-Plex [i.e. IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12, IL-13, IL-17, granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF), interferon (IFN)-γ, TNF-α, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), macrophage inflammatory protein (MIP)-1β, monocyte chemotactic protein (MCP)-1], concentración de NO, presencia de iNOS y cambios en los patrones de nitración proteica), que permitieron demostrar la elevada capacidad antiinflamatoria y antioxidante de estos compuestos (triterpenos) del aceite de oliva. Igualmente se demostró (por procedimientos análogos), el carácter antiinflamatorio de las harinas derivadas de semillas de olivo que fueron añadidas a los cultivos ex vivo de sangre de pacientes, y que fue especialmente evidente en pacientes diabéticos tipo 2 en los cuales se detectó una disminución de la inflamación subclínica subyacente a esta patología. Estos ensayos con harinas de semillas fueron además confirmados en otro sistema experimental, consistente en experimentos en cultivos celulares de células pancreáticas, inducidos con tres inductores diferenciales de inflamación En el caso de las proteínas de altramuz, se utilizaron las formas recombinantes (rβ1, rβ2, rβ3, rβ4 y rβ6) de las conglutinas del altramuz de hoja estrecha, purificadas mediante cromatografía de afinidad. Estas proteínas fueron ensayadas en diversos sistemas biológicos que incluyen su co-cultivo ex vivo con sangres de pacientes sanos y diabéticos/síndrome metabólico, cultivos in vitro de células pancreáticas, y cultivos in vitro de células pancreáticas en las que se había inducido tolerancia a insulina. En este caso, además de los marcadores de inflamación y del estado oxidativo más relevantes mencionados anteriormente, se analizaron marcadores adicionales como la carbonilación proteica, y marcadores implicados en la ruta de señalización de la insulina y otros, como IRS-1, GLUT4, CCL5, CCR2, ICAM-1 y NF-κB1 (p50), proteína kinasa B (AKT). También se realizaron análisis de la capacidad de unión directa de estas conglutinas recombinantes con la insulina y un análisis de la fosforilación de IRS-1. Estos estudios concluyeron que las conglutinas rβ1, rβ3, y rβ6 son capaces de reducir la expresión y la presencia de moléculas proinflamatorias y el estado oxidativo en general, e incrementar por otra parte la expresión de receptores y transportadores de la insulina, favoreciendo posiblemente el reconocimiento y el control de los niveles de ésta. Las isoformas rβ2 y rβ4 son, por el contrario, favorecedoras de un estado inflamatorio y no tuvieron efecto sobre la señalización de la insulina. En el caso de células resistentes a la insulina, las conglutinas recombinantes rβ1, rβ3, y rβ6 fueron capaces de mejorar notablemente los niveles de los marcadores más relevantes referentes a inflamación y estado oxidativo de los cultivos resistentes. Esta Tesis Doctoral ha permitido, por tanto, desarrollar herramientas y procedimientos capaces de diseccionar los efectos potencialmente nutracéuticos de diferentes componentes agroalimentarios, ejemplificándolos en el caso de dos alimentos de amplia utilización como son la aceituna (y sus derivados) y el altramuz. Este conocimiento es de utilidad para la industria agroalimentaria y desarrolla nuevos aspectos de la salud, probablemente aplicables al tratamiento de diversas patologías como la diabetes tipo 2. 2021-04-19T12:28:52Z 2021-04-19T12:28:52Z 2021 2021-04-07 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis Alché Ramírez, Víctor. Evaluación de los efectos inmunológicos de nuevos componentes de alto valor biológico elaborados por la industria alimentaria. Granada: Universidad de Granada, 2021. [http://hdl.handle.net/10481/68000] 978-84-1306-836-7 http://hdl.handle.net/10481/68000 spa http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/ info:eu-repo/semantics/openAccess Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 España Universidad de Granada