The role of RAB10 and RAB29 in endolysosomal trafficking alterations mediated by pathogenic LRRK2

Abstract

Point mutations in the gene encoding the Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) are the most common cause of autosomal dominant familial Parkinson’s Disease, while certain variants can also increase risk of developing sporadic PD. LRRK2 has been implicated in several cellular processes including mitochondrial function, cytoskeletal dynamics and vesicular trafficking events. The latter include endocytosis, autophagy, retromer-mediated recycling and endolysosomal trafficking pathways. The exact molecular mechanisms responsible for the LRRK2-mediated defects in these trafficking pathways remain largely unknown. A subset of the RAB family of small GTPases including RAB8A and RAB10 have been identified to act as LRRK2 substrates, and RAB29 is an important LRRK2 interacting protein. Previous work showed that pathogenic LRRK2 mediates defects in the endolysosomal degradation and recycling of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) by phosphorylating and inactivating RAB8A, which causes a decrease in RAB7A activity. Here, we analyzed the role of the most prominent LRRK2 kinase substrate RAB10 and the role of the LRRK2 interactor RAB29 in the trafficking defects mediated by pathogenic G2019S LRRK2. We find that expression of active RAB10 rescues the G2019S LRRK2-mediated phenotypes on endolysosomal trafficking, while RAB10 knockdown mimics those defects which correlates with a decrease in RAB7A activity, identical to that previously described for RAB8A. The EGFR endolysosomal trafficking impairments caused by either G2019S LRRK2 expression or RAB10 knockdown results in the accumulation of EGF in a RAB4-positive endocytic recycling compartment, which is reversed by active RAB7A, active RAB8A or active RAB10 expression but not by either of their WT or inactive versions. Furthermore, we find that WT RAB29, previously reported to recruit LRRK2 to the Golgi Apparatus (GA), efficiently rescues G2019S LRRK2-caused impairments in EGFR degradation and reverts the accumulation of EGF in a RAB4-positive endocytic recycling compartment, without causing LRRK2 recruitment to the Golgi apparatus. Inactive variants of RAB29 are unable to rescue the described impairments. Upon higher expression levels, WT RAB29 is able to recruit LRRK2 to the Golgi apparatus but fails to rescue the G2019S LRRK2-mediated deficits in EGFR trafficking. Finally, WT RAB29 but not its inactive variants reverts the described EGFR trafficking impairments mediated by not only G2019S LRRK2 expression, but also by knockdown of either RAB8A or RAB10 or dominant-negative RAB7A expression, in a manner which is independent of Golgi apparatus structural integrity. Together, these data suggest a mechanism underlying the endolysosomal trafficking deficits mediated by pathogenic LRRK2 by which it phosphorylates RAB8A and RAB10 thus causing their inactivation, which also leads to a decrease in RAB7A activity. We find that RAB8A and RAB10 play redundant roles in regulating EGFR recycling and endolysosomal trafficking events. Lastly, we report a novel role for RAB29 in regulating endocytic recycling and endolysosomal trafficking events which is independent on its role at the Golgi complex.

Mutaciones puntuales en el gen que codifica la quinasa 2 rica en repeticiones de leucina 2 (Leucine-Rich Repeat Kinase 2, LRRK2) son la causa más común de la enfermedad de Párkinson (EP) familiar autosómica dominante, mientras que ciertas variantes también pueden aumentar el riesgo de desarrollar EP esporádica. LRRK2 se ha visto implicada en varias funciones celulares, incluyendo la función mitocondrial, las dinámicas del citoesqueleto y los eventos de tráfico vesicular. Estos últimos incluyen endocitosis, LRRK2 G2019S en la degradación de EGFR y revierte la acumulación de EGF en un compartimiento de reciclaje endocítico positivo para RAB4, sin causar el reclutamiento de LRRK2 en el aparato de Golgi. Las variantes inactivas de RAB29 son incapaces de rescatar las deficiencias descritas. A mayores niveles de expresión, RAB29 silvestre es capaz de reclutar LRRK2 en el aparato de Golgi pero no consigue rescatar los déficits en el tráfico de EGFR mediados por LRRK2 G2019S. Por último, RAB29 silvestre, pero no sus variantes inactivas, revierte las deficiencias descritas en el tráfico de EGFR mediadas no sólo por la expresión de LRRK2 G2019S, sino también por la eliminación de RAB8A o RAB10, o la expresión de RAB7A negativa dominante, de una manera que es independiente de la integridad estructural del aparato de Golgi. En conjunto, estos datos sugieren un mecanismo subyacente al déficit de tráfico endolisosomal mediado por LRRK2 patogénica por el cual fosforila a RAB8A y RAB10, causando así su inactivación, lo que también conduce a una disminución de la actividad RAB7A. Descubrimos que RAB8A y RAB10 juegan papeles redundantes en la regulación de los eventos de reciclaje y tráfico endolisosomal del EGFR. Por último, reportamos un nuevo papel de RAB29 en la regulación del reciclaje endocítico y el tráfico endolisosomal, que es independiente de su papel en el complejo de Golgi. autofagia, reciclaje mediado por retrómero y las rutas de tráfico endolisosomal. Los mecanismos moleculares exactos responsables de los defectos mediados por LRRK2 en estas vías de tráfico siguen siendo en gran parte desconocidos. Se ha identificado que un subconjunto de pequeñas GTPasas pertenecientes a la familia RAB, incluyendo a RAB8A y RAB10, actúan como sustratos de LRRK2. Tambien se ha descrito que RAB29 es una importante proteína que interactúa con LRRK2. Trabajos previos han demostrado que LRRK2 patogénica media defectos en la degradación endolisosomal y en el reciclaje del receptor del factor de crecimiento epidérmico (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) fosforilando e inactivando RAB8A, lo que provoca una disminución de la actividad de RAB7A. En este trabajo analizamos el papel del sustrato más prominente de la quinasa LRRK2, RAB10, y el papel del interactor de LRRK2, RAB29, en los defectos de tráfico mediados por LRRK2 patogénica, G2019S. Encontramos que la expresión de RAB10 activo rescata los fenotipos mediados por LRRK2 G2019S en el tráfico endolisosomal, mientras que el silenciamiento de RAB10 mimetiza esos defectos que se correlacionan con una disminución de la actividad de RAB7A, idéntica a la descrita previamente para RAB8A. Las deficiencias en el tráfico endolisosomal del EGFR causados tanto por LRRK2 G2019S como por el silenciamiento de RAB10 resultaron en la acumulación de EGFR en un compartimento alternativo del reciclaje endocítico positivo para RAB4, la cual fue revertida por la expresión de RAB7A, RAB8A y RAB10 activas pero no por ninguna de sus versiones silvestres o inactivas. Las alteraciones en el tráfico endolisosomal del EGFR causadas por la expresión de LRRK2 G2019S o por el silenciamiento de RAB10 resultan en la acumulación de EGF en un compartimento de reciclaje endocítico positivo para RAB4, que se revierte por la expresión de RAB7A activo, RAB8A activo o RAB10 activo pero no por ninguna de sus versiones silvestres o inactivas. Además, encontramos que RAB29 silvestre, previamente reportada como reclutadora de LRRK2 al aparato de Golgi, rescata eficientemente los defectos causados por