Deciphering the genetic basis of systemic sclerosis

Abstract

Systemic sclerosis, or scleroderma (SSc), is a complex immunemediated inflammatory disorder. SSc pathogenesis involves a triad of factors: immunological imbalance characterized by the presence of autoantibodies. pronounced vascular damage and extensive fibrosis of the skin and the internal organs. Clinically, SSc can be classified based on the extension of fibrosis. When it primarily affects the face and limbs, it is referred to as limited cutaneous SSc (lcSSc), while when it involves internal organs, it is defined as diffuse cutaneous SSc (dcSSc). Additionally, SSc can be classified by the autoantibodies generated by the patient, the predominant types being anti-topoisomerase (ATA+) and anti-centromere (ACA+), that correlate with dcSSc and lcSSC, respectively. SSc has a clear genetic component and the role of common genetic variants in the susceptibility to SSc has been explored by using high throughput genotyping techniques such as genome-wide association studies (GWAS) arrays. The latest GWAS in the disease, published in 2019, identified 27 loci associated with SSc, discovering 13 new ones and providing new insights into the molecular pathways and specific cell types implicated in the pathogenesis of the disease. In addition, the mentioned large genomic study established solid grounds for comprehensive follow-up studies and data mining strategies. Consequently, the main aim of this doctoral thesis research was to further understand the biological mechanisms involved in SSc by applying novel analysis strategies on GWAS datasets and to generate and analyze the gene expression profiles of relevant cell subtypes at the single cell level. A straightforward application of the identification of genetic risk factors and the estimation of their effects in large GWASs is the generation of polygenic or genomic risk scores (PRS or GRS, respectively). This method enabled us to identify individuals at risk of developing the disease based on the presence of specific alleles in known disease-associated loci. In this doctoral thesis, we developed a 33 single nucleotide polymorphism (SNP) GRS that was proven to be able to differentiate between healthy individuals and SSc patients. Moreover, the generated GRS showed a relevant clinical management potential, as it could distinguish between individuals with SSc and those with two related immune-mediated disorders such as rheumatoid arthritis and Sjögren's syndrome, especially when genetic information was combined with immune cell count data. On the other hand, two-sample Mendelian randomization methods allowed the scientific community to combine GWAS results for diseases and environmental risk factors to address the causality of risk factors on disease onset. High levels of body fat or obesity are known risk factors for numerous diseases, including immune-mediated diseases. Obesity is associated with a state of chronic low-level inflammation, in which adipocytes release proinflammatory cytokines. Therefore, this thesis included the study of the causal contribution of body fat distribution to the SSc. We utilized GWAS data from public repositories for anthropometric measures of body fat distribution, including body mass index (BMI), waist-to-hip ratio, and BMI adjusted for waist-to-hip ratio. However, our analyses did not reveal a causal relationship between SSc and any of these obesity-related anthropometric measures. Finally, based on previous knowledge, monocytes were selected as targets cells to study in order to better understand the SSc pathogenesis. Monocytes are myeloid cells that circulate in the blood with various functions in innate immunity, ranging from direct action against threats to the activation of other cell types and chemotaxis. Therefore, we isolated monocytes from peripheral blood in patients and controls and using singlecell transcriptome analysis (scRNA-seq), we identified aberrant gene expression profiles in SSc patients. Briefly, non-classical monocytes (ncMos) were found in higher proportions in SSc patients, and SSc ncMos also expressed increased levels of PTGES and interferon-mediated activation. PTGES encodes a prostaglandin E2 synthase, which was previously proposed as a therapeutic target in inflammation and may also be relevant for SSc patients. A SSc-related cluster of IRF7+ STAT1+ intermediate monocyte subset with an aberrant interferon response was also described. Additionally, we identified a M2-polarized population of classical monocytes that was depleted in patients. Considering that M2 macrophages are profibrotic, we hypothesized that these monocyte subset is being activated and migrating to tissues in SSc patients. The results presented in this doctoral thesis signify a step forward in the genetic exploration of SSc from various perspectives. First, we employed previously published GWAS data to predict SSc onset based on genetic variants. Second, we utilized the same GWAS data to establish body fat distribution as a predisposing risk factor for the disease. Third, we employed cutting-edge techniques like scRNA-seq to describe circulating blood monocytes and their potential role in the disease.

La esclerosis sistémica, o esclerodermia (SSc), es un trastorno inflamatorio mediado por el sistema inmunológico de etiología compleja. La patogénesis de la enfermedad involucra una tríada de factores: desequilibrio inmunológico caracterizado por la presencia de autoanticuerpos daño vascular pronunciado y fibrosis extensa de la piel y los órganos internos. Clínicamente, la SSc se puede clasificar según la extensión de la fibrosis. Cuando afecta principalmente la cara y las extremidades, se denomina esclerósis sistémica cutánea limitada (lcSSc), mientras que cuando involucra órganos internos, se define como esclerosis sistémica cutánea difusa (dcSSc). Además, la SSc se puede clasificar según los autoanticuerpos generados por el paciente, siendo los tipos predominantes la anti-topoisomerasa (ATA+) y los anticentrómero (ACA+), que se correlacionan con dcSSc y lcSSC, respectivamente. La SSc es una enfermedad con un fuerte componente genético, estudiado en los últimos años gracias a técnicas de genotipado como los estudios de asociación de genoma completo (GWAS). El último GWAS en la enfermedad, publicado en 2019, identificó 27 loci asociados con la ES, descubriendo 13 nuevos y proporcionando nuevas perspectivas sobre las rutas moleculares y los efectos celulares específicos implicados en la patogénesis de la enfermedad. Adicionalmente, este gran estudio genómico estableció bases sólidas para estudios de seguimiento y estrategias de minería de datos. En consecuencia, el principal objetivo de esta tesis doctoral fue comprender mejor los mecanismos biológicos involucrados en la SSc mediante la aplicación de nuevas estrategias de análisis en conjuntos de datos de GWAS y generar y analizar los perfiles de expresión génica de subtipos celulares relevantes a nivel de células única. Una aplicación directa de la identificación de factores de riesgo genéticos y la estimación de sus efectos en GWAS de grandes cohortes son los índices de riesgo poligénico o genómico (PRS o GRS, respectivamente). Esta técnica permite identificar a las personas en riesgo de desarrollar la enfermedad según la presencia de alelos específicos en los loci asociados a la enfermedad. En esta tesis doctoral, desarrollamos un GRS de 33 SNP que demostró ser capaz de diferenciar entre individuos sanos y pacientes con SSc. Además, el GRS generado mostró un potencial relevante en la gestión clínica, ya que podía distinguir entre individuos con SSc y aquellos con dos enfermedades autoinmunes relacionadas, como la artritis reumatoide y el síndrome de Sjögren, especialmente cuando se combinó información genética con datos de recuento de células inmunitarias. Por otro lado, los métodos de aleatorización mendeliana de dos muestras permitieron a la comunidad científica combinar los resultados de GWAS para enfermedades y factores de riesgo ambientales para abordar la relación causal entre ellos. Los altos niveles de grasa corporal u obesidad son factores de riesgo conocidos para numerosas enfermedades, incluidas los transtornos mediados por el sistema inmunológico. La obesidad está asociada con un estado de inflamación crónica de bajo nivel, en el cual los adipocitos liberan citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, esta tesis incluye el estudio de la contribución causal de la distribución de grasa corporal a la SSc. Utilizamos datos de GWAS de repositorios públicos para medidas antropométricas de distribución de grasa corporal, incluyendo el índice de masa corporal (IMC), el ratio cintura-cadera y el IMC ajustado por el ratio cintura-cadera. Sin embargo, nuestros análisis no revelaron una relación causal entre la SSc y ninguna de estas medidas antropométricas relacionadas con la obesidad. Finalmente, en base al conocimiento previo, los monocitos se seleccionaron como células objetivo para nuestro estudio, con el fin de comprender mejor la patogénesis de la SSc. Los monocitos son células mieloides que circulan en la sangre con diversas funciones en la inmunidad innata, que van desde la acción directa contra amenazas hasta la activación de otros tipos celulares y la quimiotaxis. Por lo tanto, aislamos monocitos de sangre periférica en pacientes y controles y, utilizando análisis de transcriptoma de células únicas (scRNA-seq), se identificaron perfiles de expresión génica aberrantes en pacientes con SSc. Se encontró una mayor proporción de monocitos no clásicos (ncMos) en pacientes con SSc, y estos también expresaron niveles aumentados de PTGES y activación mediada por interferón. PTGES codifica una prostaglandina E2 sintasa, que previamente se ha propuesto como un objetivo terapéutico en la inflamación y que también puede ser relevante para los pacientes con SSc. También se describió un grupo celular relacionado con la SSc de un subconjunto de monocitos intermedios que expresan IRF7+ STAT1+ con una respuesta de interferón aberrante. Además, identificamos una población de monocitos clásicos polarizados a macrofagos M2 que estaba deplecionado en los pacientes. Dado que los macrófagos M2 son células profibróticas, planteamos la hipótesis de que este subconjunto de monocitos se activa y migra a los tejidos en pacientes con SSc. Los resultados presentados en esta tesis doctoral representan un avance en la exploración genética de la SSc desde diversas perspectivas. En primer lugar, al utilizar datos de GWAS previamente publicados para predecir la aparición o distinguir la enfermedad de otras basado en variantes genéticas. En segundo lugar, al utilizar los mismos datos de GWAS para intentar dilucidar si la distribución de grasa corporal es un factor de riesgo para la enfermedad. En tercer lugar, al utilizar técnicas de vanguardia como scRNA-seq para describir los monocitos de la sangre circulante y su papel potencial en la SSc.