Evaluación de metodologías analíticas avanzadas para el control de plaguicidas y toxinas naturales en aguas, alimentos y nutracéuticos

Abstract

In this Thesis, different analytical strategies using different techniques have been proposed for the determination of residues of fipronil insecticide and its metabolites and cyanotoxins in food products and environmental waters. Fipronil is an insecticide derived from the phenylpirazole family which is well-known for disturbing the γ-aminobutyric acid (GABA)-gated chloride channels from the cell membranes in the central nervous system. Disruption of the GABA receptors by fipronil prevents the uptake of chloride ions resulting in excess neuronal stimulation and death of the insect. Even though it is known that this insecticide has higher binding affinity for insect receptor complexes, sometimes its effects are negative on other organisms such as vertebrates and humans, thus, it is authorized in the European Union (EU) as a antiparasitic drug for pet animals, but not for food producing animals. In addition, fipronil-sulfone, the primary biological metabolite of fipronil, is reported to be twenty times more active at mammalian chloride channels than at insect ones. In the case of foodstuff, current legislation establishes a maximum residues limit (MRL), which must not be surpassed to guarantee the quality of the product and to permit its distribution and consumption. The approval of fipronil as an agricultural insecticide expired in 2017 and thus, the Commission Regulation (EU) 2019/1792 modified its MRL (as sum of fipronil and fipronil-sulfone) established for foodstuffs, set in the analytical determination limit of 0.005 mg/kg. However bad practices or handling errors sometimes cause that fipronil or its metabolite residues can be found in foodstuffs at levels above this value. If this happens, alerts about their presence in products of animal origin destined to human consumption are notified by the Rapid System of Food and Feed RASFF) portal, which provides EU authorities a tool for the exchange of information on the measures taken when a risk is detected in feed or food. This happened with the health alert incident occurred in 2017 in Europe as a result of fipronil contamination of chicken eggs from poultry farms in Netherland and Belgium intended for human consumption. On the other hand, the presence of not only pesticides, but emerging natural toxins is a matter of interest and awareness. Cyanotoxins are toxic secondary metabolites produced by some genera of cyanobacteria, also known as blue-green algae. Cyanobacteria is a group of oxygenic prokaryotes which habits in a wide variety of freshwater and marine ecosystems and, under certain environmental conditions, such as high levels of nutrients, they reproduce exponentially forming blooms. As a result, cyanotoxins present in water can negatively affect different species and accumulate in animals such as fish and shellfish causing shellfish poisoning through the food chain. In fact, cyanotoxins can be present in different food products such as dietary supplements based on cyanobacteria. Cyanotoxins include potent neurotoxins, hepatotoxins, cytotoxins, compounds with a wide variety of structures and physicochemical properties. However, cyanotoxicity has not been closely studied and therefore the World Health Organization (WHO) has established a drinking water guideline of 1 μg/L only for the most explored cyanotoxin, microcystin-LR. Considering these concerns, it is obvious that sensitive, selective and effective analytical methods are required for the determination of these compounds in the fields of food and environmental safety to: a) Monitor the concentration of pesticide residues, particularly the insecticide fipronil and its metabolite fipronil-sulfone, to ensure the quality and safety of food products and to fulfill the current European legislation. b) Study and evaluate the presence and potential health risks associated with less studied or emerging natural toxic compounds, such as cyanotoxins. In general, to face with the analytical challenges abovementioned several techniques have been taken into consideration. The proposed methods are based on miniaturized separation techniques, such as capillary electrophoresis (CE) and capillary liquid chromatography (CLC) as they involve low sample volume, low solvent consumption and low waste generation, being recommended as green analytical techniques. Furthermore, the use of high efficiency techniques such as ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) has also been investigated as it offers a lower solvent consumption than in conventional LC methods, higher efficiency and shorter analysis time. Besides UV-Vis detection, mass spectrometry (MS) has been considered in this Thesis due to its advantages such as higher sensitivity and selectivity and its capability to identify unequivocally a large number of compounds. Finally, the coupling of ion mobility spectrometry (IMS) to LC-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) workflow has been assessed as it provides complementary information by means of the collision cross section (CCS) parameter, which can be derived from such a technique. At the same time, suitable sample treatment methods have been investigated to achieve the extraction and preconcentration of the analytes. It is worthy to mention that this Thesis has sought to obtain novel contributions by exploring alternative methodologies to conventional ones to address these problems. Therefore, it has been developed the first application of CE method for the determination of fipronil and its metabolites in egg samples. Furthermore, it is addressed for the first time the joint determination of cyanotoxins from different families, and therefore, with different characteristics, and the characterization in terms of CCS of a high number of cyanotoxins employing travelling wave ion mobility (TWIMS) coupled to quadrupole time-of-flight high resolution mass spectrometry (QTOF-HRMS). The present Thesis has been divided into two different parts. Part I presents an introduction including relevant aspects related with the insecticides under study and the experimental work developed. The following chapters are included in this part: • Chapter 1 describes a method based on CE in its micellar electrokinetic chromatography mode (MEKC) with ultraviolet detection (UV) as a novel approach for the determination of fipronil and its main metabolite, fipronilsulfone in chicken egg samples. With this purpose, a sample treatment based on salting out liquid-liquid extraction (SALLE) was developed to efficiently extract the analytes. • Chapter 2 involves the employ of CLC coupled to UV as a miniaturized technique for the separation and determination of fipronil and two of its main metabolites, fipronil-sulfone and fipronil-sulfide in chicken egg samples. SALLE was the extraction technique employed to extract the target analytes from the matrix of interest. On the other hand, in Part II an introduction with valuable information about cyanobacteria, cyanotoxins and analytical methods is provided as well as the methods developed in this Thesis involving those analytes. The following chapters can be found in this part: • Chapter 3 deals with a comprehensive study of the determination of cyanotoxins from different families in reservoir water samples using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled to tandem MS detection (MS/MS). To achieve the simultaneous extraction of the analytes a novel sample treatment method based on tandem solid phase extraction (SPE) was developed. • Chapter 4 consists of the development of a method based on HILIC-MS/MS to determine cyanotoxins from different families in cyanobacteria based dietary supplements. A sample treatment based on solid-liquid extraction (SLE) followed by a tandem-SPE was employed. The method was applied to different dietary supplements samples to study the occurrence of cyanotoxins and evaluate the potential health risk. • Chapter 5 presents the research carried out with the supervision of the Professors Dr. Chiara Dall’Asta and Dr. Laura Righetti during the predoctoral research stay at the University of Parma (Parma, Italy). The work consisted of the development of a CCS database as a complementary parameter to characterize 20 cyanotoxins and one marine biotoxin employing travelling wave ion mobility coupled to quadrupole time-of-flight (TWIMS- QTOF) method. The obtained results were discussed, and then, a screening of cyanotoxins was carried out in several dietary supplement samples to evaluate their occurrence.

En esta Tesis se han propuesto diferentes estrategias analíticas usando diferentes técnicas para la determinación de residuos del insecticida fipronil y sus metabolitos y de cianotoxinas en productos alimenticios y aguas medioambientales. Fipronil es un insecticida derivado de la familia de los fenilpirazoles, el cual es conocido por perturbar el canal de cloruro regulado por el ácido γ-aminoburírico (GABA) de las membranas celulares en el sistema nervioso central. La perturbación por fipronil de los receptores de GABA impide la captación de iones cloruro, lo que provoca un exceso de estimulación neuronal y la muerte del insecto. Aunque se sabe que este insecticida tiene una mayor afinidad de unión a los complejos receptores de los insectos, a veces sus efectos son negativos en otros organismos como los vertebrados y los seres humanos y por tanto en la Unión Europea (UE) está autorizado como medicamento antiparasitario para animales de compañía, pero no para animales productores de alimentos. Además, se sabe que fipronil-sulfona, el principal metabolito biológico del fipronil, es veinte veces más activo en los canales de cloruro de los mamíferos que en los de los insectos. En el caso de los alimentos, la legislación vigente establece límites máximos de residuos (LMR), que no deben superarse para garantizar la calidad del producto y permitir su distribución y consumo. La aprobación del fipronil como insecticida en agricultura expiró en 2017 y, por tanto, en el reglamento (UE) 2019/1792 se modificó su LMR (como suma de fipronil y fipronil sulfona) establecidos para alimentos, fijado en el límite de determinación analítica, proponiéndose un valor de 0,005 mg/kg. Sin embargo, las malas prácticas o los errores de manipulación hacen que se encuentren residuos de este pesticida o su metabolito principal en alimentos que a veces se supera este valor. Si esto ocurre, las alertas sobre su presencia en alimentos de origen animal destinados al consumo humano se notifican a través del portal del Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos (RASFF), que proporciona a las autoridades de la UE una herramienta para el intercambio de información sobre las medidas adoptadas cuando se detecta un riesgo en piensos o alimentos. Así ocurrió con el incidente de la alerta sanitaria ocurrido en 2017 en Europa como consecuencia de la contaminación por fipronil de huevos de granjas de los Países Bajos y Bélgica destinados al consumo humano. Por otro lado, la presencia no sólo de plaguicidas, sino de toxinas naturales emergentes es un tema de interés y concienciación. Las cianotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos producidos por algunos géneros de cianobacterias, también conocidas como algas verdeazuladas. Las cianobacterias son un grupo de procariotas oxigénicas que habitan en una gran variedad de ecosistemas marinos y de agua dulce, y en determinadas condiciones, como en medios con altos niveles de nutrientes, se reproducen exponencialmente formando floraciones. Como resultado, las cianotoxinas presentes en el agua pueden afectar negativamente a diferentes especies y acumularse en animales como peces y mariscos, causando intoxicaciones a través de la cadena alimentaria. De hecho, las cianotoxinas pueden estar presentes en diferentes productos alimenticios como son los complementos dietéticos a base de cianobacterias. En las cianotoxinas se incluyen potentes neurotoxinas, hepatotoxinas y citotoxinas, compuestos con una gran variedad de estructuras y propiedades físico-químicas. Sin embargo, la toxicidad de estos compuestos no se ha estudiado aún en profundidad y, por tanto, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido un valor regulado para agua potable de 1 μg/L solo para la cianotoxina más estudiada, la microcistina-LR. En relación con toda la problemática anterior, es evidente que se requieren métodos analíticos sensibles, selectivos y eficaces para la determinación de estos compuestos en el ámbito de la seguridad alimentaria y medioambiental para: a) Controlar la concentración de residuos y metabolitos de plaguicidas, en concreto de fipronil y su metabolito, fipronil sulfona, para garantizar la calidad y seguridad de los productos alimentarios y cumplir con la legislación europea vigente. b) Estudiar y evaluar la presencia y los potenciales riesgos para la salud asociados a compuestos tóxicos naturales, como las cianotoxinas, menos estudiados o emergentes. En general, para hacer frente a los restos analíticos mencionados, se han considerado distintas técnicas. Los métodos propuestos se basan en técnicas de separación miniaturizadas, como la electroforesis capilar (CE) y la cromatografía líquida capilar (CLC), ya que implican un bajo volumen de muestra y un bajo consumo de disolventes y de generación de residuos, siendo recomendada como una técnica analítica verde. Además, también se ha investigado el uso de técnicas de alta eficiencia, como la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC), ya que ofrece un menor consumo de disolvente que los métodos LC convencionales, una mayor eficiencia y un tiempo de análisis más corto. Además de la detección UV-Vis, en esta Tesis se ha considerado la espectrometría de masas (MS) debido a sus ventajas, como una mayor sensibilidad y selectividad y su capacidad para identificar inequívocamente un gran número de compuestos. Por último, se ha evaluado el acoplamiento de la espectrometría de movilidad iónica (IMS) al flujo de trabajo LC acoplado a espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS), ya que proporciona información complementaria mediante el parámetro denominado sección transversal de colisión (CCS) que puede derivarse de dicha técnica. Al mismo tiempo, se han investigado métodos de tratamiento de muestra para lograr la extracción y preconcentración de los analitos de manera adecuada. Cabe destacar que en esta Tesis se ha intentado llevar a cabo aportaciones novedosas explorando metodologías alternativas a las convencionales para abordar estos problemas. Así, se ha desarrollado la primera aplicación de la electroforesis capilar en la determinación de fipronil y sus metabolitos en muestras de huevo. Además, se aborda por primera vez la determinación conjunta de cianotoxinas de diversas familias y por tanto con características físico-químicas muy diferentes y la caracterización en términos de CCS de un gran número de cianotoxinas empleando movilidad iónica de onda viajera (TWIMS) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con analizador de cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF-HRMS). Esta Tesis se ha dividido en dos partes diferenciadas. La Parte I presenta una introducción que incluye aspectos relevantes relacionados con los insecticidas objeto de estudio y recopila el trabajo experimental desarrollado. En esta parte se incluyen los siguientes capítulos: • El Capítulo 1 describe un método basado en CE en su modo de cromatografía electrocinética micelar (MEKC) con detección por batería de diodos (DAD) como un enfoque novedoso para la determinación de fipronil y su principal metabolito, fipronil-sulfona en muestras de huevos de gallina. Con este fin se desarrolló un tratamiento de muestra basado en la extracción líquido-líquido asistida por sales (SALLE) para extraer eficientemente los analitos. • El Capítulo 2 trata del empleo de la CLC acoplada a DAD como técnica miniaturizada para la separación y determinación de fipronil y dos de sus principales metabolitos, fipronil-sulfona y fipronil-sulfuro, en muestras de huevos de gallina. SALLE fue la técnica de extracción empleada para extraer los analitos diana de la matriz de interés. Por otro lado, en la Parte II se ofrece una introducción con información de interés sobre las cianobacterias, cianotoxinas y métodos de análisis, así como los métodos desarrollados en esta Tesis para dichos analitos. En esta parte se encuentran los siguientes capítulos: • El Capítulo 3 incluye un estudio exhaustivo de la determinación de cianotoxinas de diferentes familias en muestras de agua de embalses mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) acoplada a detección MS en tándem (MS/MS). Para lograr la extracción simultánea de los analitos se desarrolló un novedoso método de tratamiento de muestra basado en la extracción en fase sólida (SPE) en tándem. • El Capítulo 4 consiste en el desarrollo de un método basado en HILIC-MS/MS para la determinación de cianotoxinas de diferentes familias en suplementos dietéticos basados en cianobacterias. Se empleó un tratamiento de muestra basado en extracción sólido-líquido (SLE) seguido de una SPE en tándem. El método se aplicó a diferentes muestras de suplementos dietéticos para estudiar la presencia de cianotoxinas y evaluar el riesgo potencial para la salud. • El Capítulo 5 presenta la investigación realizada bajo la supervisión de las profesoras Dra. Laura Righetti y Dra. Chiara Dall’Asta durante la estancia de investigación predoctoral en la Universidad de Parma (Parma, Italia). El trabajo consistió en el desarrollo de una base de datos de CCS como un parámetro complementario para la caracterización de 20 cianotoxinas y una biotoxina marina empleando un método de movilidad iónica de onda viajera acoplado a espectrometría de masas de cuadrupolo-tiempo de vuelo (TWIMS-QTOF-MS). Se discutieron los resultados obtenidos y posteriormente se llevó a cabo un cribado de cianotoxinas en varias muestras de suplementos dietéticos para evaluar su presencia.