Evaluación de metodologías analíticas avanzadas para el control de plaguicidas y toxinas naturales en aguas, alimentos y nutracéuticos
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Universidad de Granada
Departamento
Universidad de Granada. Programa de Doctorado en QuímicaDate
2023Fecha lectura
2023-03-31Referencia bibliográfica
Aparicio Muriana, María del Mar. Evaluación de metodologías analíticas avanzadas para el control de plaguicidas y toxinas naturales en aguas, alimentos y nutracéuticos. Granada: Universidad de Granada, 2023. [https://hdl.handle.net/10481/81262]
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Tesis Univ. Granada.; PID2021-127804OB-I00 (Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities). New analytical strategies for the monitoring of emerging risks in food safety based on capillary electrophoresis and ion mobility coupled to mass spectrometry.; B-AGR-202-UGR20 (Junta de Andalucía, FEDER Andalusia Operational Program 2014-2020). Control of emerging organic contaminants in food in Andalusia: advanced analytical strategies for safe consumption.; RTI2018-097043-B-I00 (Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities). Towards a safe consumption of nutraceuticals: analytical evaluation of the presence of emerging mycotoxins and cyanotoxins by advanced techniques (NUTRATOX).; AGL2015-70708-R (Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities). Chemical hazards in nutraceuticals: advanced analytical proposals for the determination of mycotoxins and pesticides.; RED2018-10522-T (Spanish Ministry of Science, Innovation, and Universities). Spanish Network of Excellence in Sample preparation - Sample Preparation Task Force and Network, supported by the Division of Analytical Chemistry of the European Chemical Society.; Grant (FPU17/03810) financed by Government of Spain-Ministry of Education, Culture and Sports.Résumé
In this Thesis, different analytical strategies using different techniques have been
proposed for the determination of residues of fipronil insecticide and its metabolites and
cyanotoxins in food products and environmental waters.
Fipronil is an insecticide derived from the phenylpirazole family which is well-known
for disturbing the γ-aminobutyric acid (GABA)-gated chloride channels from the cell
membranes in the central nervous system. Disruption of the GABA receptors by fipronil
prevents the uptake of chloride ions resulting in excess neuronal stimulation and death
of the insect. Even though it is known that this insecticide has higher binding affinity for
insect receptor complexes, sometimes its effects are negative on other organisms such as
vertebrates and humans, thus, it is authorized in the European Union (EU) as a
antiparasitic drug for pet animals, but not for food producing animals. In addition,
fipronil-sulfone, the primary biological metabolite of fipronil, is reported to be twenty
times more active at mammalian chloride channels than at insect ones. In the case of
foodstuff, current legislation establishes a maximum residues limit (MRL), which must
not be surpassed to guarantee the quality of the product and to permit its distribution
and consumption. The approval of fipronil as an agricultural insecticide expired in 2017
and thus, the Commission Regulation (EU) 2019/1792 modified its MRL (as sum of
fipronil and fipronil-sulfone) established for foodstuffs, set in the analytical
determination limit of 0.005 mg/kg. However bad practices or handling errors sometimes
cause that fipronil or its metabolite residues can be found in foodstuffs at levels above
this value. If this happens, alerts about their presence in products of animal origin
destined to human consumption are notified by the Rapid System of Food and Feed RASFF) portal, which provides EU authorities a tool for the exchange of information on
the measures taken when a risk is detected in feed or food. This happened with the health
alert incident occurred in 2017 in Europe as a result of fipronil contamination of chicken
eggs from poultry farms in Netherland and Belgium intended for human consumption.
On the other hand, the presence of not only pesticides, but emerging natural toxins is a
matter of interest and awareness. Cyanotoxins are toxic secondary metabolites produced
by some genera of cyanobacteria, also known as blue-green algae. Cyanobacteria is a
group of oxygenic prokaryotes which habits in a wide variety of freshwater and marine
ecosystems and, under certain environmental conditions, such as high levels of
nutrients, they reproduce exponentially forming blooms. As a result, cyanotoxins
present in water can negatively affect different species and accumulate in animals such
as fish and shellfish causing shellfish poisoning through the food chain. In fact,
cyanotoxins can be present in different food products such as dietary supplements based
on cyanobacteria. Cyanotoxins include potent neurotoxins, hepatotoxins, cytotoxins,
compounds with a wide variety of structures and physicochemical properties. However,
cyanotoxicity has not been closely studied and therefore the World Health Organization
(WHO) has established a drinking water guideline of 1 μg/L only for the most explored
cyanotoxin, microcystin-LR.
Considering these concerns, it is obvious that sensitive, selective and effective analytical
methods are required for the determination of these compounds in the fields of food and
environmental safety to:
a) Monitor the concentration of pesticide residues, particularly the insecticide
fipronil and its metabolite fipronil-sulfone, to ensure the quality and safety of
food products and to fulfill the current European legislation.
b) Study and evaluate the presence and potential health risks associated with less
studied or emerging natural toxic compounds, such as cyanotoxins.
In general, to face with the analytical challenges abovementioned several techniques
have been taken into consideration. The proposed methods are based on miniaturized
separation techniques, such as capillary electrophoresis (CE) and capillary liquid
chromatography (CLC) as they involve low sample volume, low solvent consumption
and low waste generation, being recommended as green analytical techniques.
Furthermore, the use of high efficiency techniques such as ultra-high performance liquid
chromatography (UHPLC) has also been investigated as it offers a lower solvent
consumption than in conventional LC methods, higher efficiency and shorter analysis
time. Besides UV-Vis detection, mass spectrometry (MS) has been considered in this
Thesis due to its advantages such as higher sensitivity and selectivity and its capability
to identify unequivocally a large number of compounds. Finally, the coupling of ion
mobility spectrometry (IMS) to LC-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS)
workflow has been assessed as it provides complementary information by means of the
collision cross section (CCS) parameter, which can be derived from such a technique. At
the same time, suitable sample treatment methods have been investigated to achieve the
extraction and preconcentration of the analytes.
It is worthy to mention that this Thesis has sought to obtain novel contributions by
exploring alternative methodologies to conventional ones to address these problems.
Therefore, it has been developed the first application of CE method for the determination
of fipronil and its metabolites in egg samples. Furthermore, it is addressed for the first
time the joint determination of cyanotoxins from different families, and therefore, with
different characteristics, and the characterization in terms of CCS of a high number of cyanotoxins employing travelling wave ion mobility (TWIMS) coupled to quadrupole
time-of-flight high resolution mass spectrometry (QTOF-HRMS).
The present Thesis has been divided into two different parts. Part I presents an
introduction including relevant aspects related with the insecticides under study and the
experimental work developed. The following chapters are included in this part:
• Chapter 1 describes a method based on CE in its micellar electrokinetic
chromatography mode (MEKC) with ultraviolet detection (UV) as a novel
approach for the determination of fipronil and its main metabolite, fipronilsulfone
in chicken egg samples. With this purpose, a sample treatment based on
salting out liquid-liquid extraction (SALLE) was developed to efficiently extract
the analytes.
• Chapter 2 involves the employ of CLC coupled to UV as a miniaturized technique
for the separation and determination of fipronil and two of its main metabolites,
fipronil-sulfone and fipronil-sulfide in chicken egg samples. SALLE was the
extraction technique employed to extract the target analytes from the matrix of
interest.
On the other hand, in Part II an introduction with valuable information about
cyanobacteria, cyanotoxins and analytical methods is provided as well as the methods
developed in this Thesis involving those analytes. The following chapters can be found
in this part:
• Chapter 3 deals with a comprehensive study of the determination of cyanotoxins
from different families in reservoir water samples using hydrophilic interaction
liquid chromatography (HILIC) coupled to tandem MS detection (MS/MS). To achieve the simultaneous extraction of the analytes a novel sample treatment
method based on tandem solid phase extraction (SPE) was developed.
• Chapter 4 consists of the development of a method based on HILIC-MS/MS to
determine cyanotoxins from different families in cyanobacteria based dietary
supplements. A sample treatment based on solid-liquid extraction (SLE) followed
by a tandem-SPE was employed. The method was applied to different dietary
supplements samples to study the occurrence of cyanotoxins and evaluate the
potential health risk.
• Chapter 5 presents the research carried out with the supervision of the Professors
Dr. Chiara Dall’Asta and Dr. Laura Righetti during the predoctoral research stay
at the University of Parma (Parma, Italy). The work consisted of the development
of a CCS database as a complementary parameter to characterize 20 cyanotoxins
and one marine biotoxin employing travelling wave ion mobility coupled to
quadrupole time-of-flight (TWIMS- QTOF) method. The obtained results were
discussed, and then, a screening of cyanotoxins was carried out in several dietary
supplement samples to evaluate their occurrence. En esta Tesis se han propuesto diferentes estrategias analíticas usando diferentes técnicas
para la determinación de residuos del insecticida fipronil y sus metabolitos y de
cianotoxinas en productos alimenticios y aguas medioambientales.
Fipronil es un insecticida derivado de la familia de los fenilpirazoles, el cual es conocido
por perturbar el canal de cloruro regulado por el ácido γ-aminoburírico (GABA) de las
membranas celulares en el sistema nervioso central. La perturbación por fipronil de los
receptores de GABA impide la captación de iones cloruro, lo que provoca un exceso de
estimulación neuronal y la muerte del insecto. Aunque se sabe que este insecticida tiene
una mayor afinidad de unión a los complejos receptores de los insectos, a veces sus
efectos son negativos en otros organismos como los vertebrados y los seres humanos y
por tanto en la Unión Europea (UE) está autorizado como medicamento antiparasitario
para animales de compañía, pero no para animales productores de alimentos. Además,
se sabe que fipronil-sulfona, el principal metabolito biológico del fipronil, es veinte veces
más activo en los canales de cloruro de los mamíferos que en los de los insectos. En el
caso de los alimentos, la legislación vigente establece límites máximos de residuos
(LMR), que no deben superarse para garantizar la calidad del producto y permitir su
distribución y consumo. La aprobación del fipronil como insecticida en agricultura
expiró en 2017 y, por tanto, en el reglamento (UE) 2019/1792 se modificó su LMR (como
suma de fipronil y fipronil sulfona) establecidos para alimentos, fijado en el límite de
determinación analítica, proponiéndose un valor de 0,005 mg/kg. Sin embargo, las malas
prácticas o los errores de manipulación hacen que se encuentren residuos de este
pesticida o su metabolito principal en alimentos que a veces se supera este valor. Si esto ocurre, las alertas sobre su presencia en alimentos de origen animal destinados al
consumo humano se notifican a través del portal del Sistema de Alerta Rápida para
Alimentos y Piensos (RASFF), que proporciona a las autoridades de la UE una
herramienta para el intercambio de información sobre las medidas adoptadas cuando se
detecta un riesgo en piensos o alimentos. Así ocurrió con el incidente de la alerta sanitaria
ocurrido en 2017 en Europa como consecuencia de la contaminación por fipronil de
huevos de granjas de los Países Bajos y Bélgica destinados al consumo humano.
Por otro lado, la presencia no sólo de plaguicidas, sino de toxinas naturales emergentes
es un tema de interés y concienciación. Las cianotoxinas son metabolitos secundarios
tóxicos producidos por algunos géneros de cianobacterias, también conocidas como
algas verdeazuladas. Las cianobacterias son un grupo de procariotas oxigénicas que
habitan en una gran variedad de ecosistemas marinos y de agua dulce, y en
determinadas condiciones, como en medios con altos niveles de nutrientes, se
reproducen exponencialmente formando floraciones. Como resultado, las cianotoxinas
presentes en el agua pueden afectar negativamente a diferentes especies y acumularse
en animales como peces y mariscos, causando intoxicaciones a través de la cadena
alimentaria. De hecho, las cianotoxinas pueden estar presentes en diferentes productos
alimenticios como son los complementos dietéticos a base de cianobacterias. En las
cianotoxinas se incluyen potentes neurotoxinas, hepatotoxinas y citotoxinas, compuestos
con una gran variedad de estructuras y propiedades físico-químicas. Sin embargo, la
toxicidad de estos compuestos no se ha estudiado aún en profundidad y, por tanto, la
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido un valor regulado para agua
potable de 1 μg/L solo para la cianotoxina más estudiada, la microcistina-LR. En relación con toda la problemática anterior, es evidente que se requieren métodos
analíticos sensibles, selectivos y eficaces para la determinación de estos compuestos en
el ámbito de la seguridad alimentaria y medioambiental para:
a) Controlar la concentración de residuos y metabolitos de plaguicidas, en concreto
de fipronil y su metabolito, fipronil sulfona, para garantizar la calidad y seguridad
de los productos alimentarios y cumplir con la legislación europea vigente.
b) Estudiar y evaluar la presencia y los potenciales riesgos para la salud asociados a
compuestos tóxicos naturales, como las cianotoxinas, menos estudiados o
emergentes.
En general, para hacer frente a los restos analíticos mencionados, se han considerado
distintas técnicas. Los métodos propuestos se basan en técnicas de separación
miniaturizadas, como la electroforesis capilar (CE) y la cromatografía líquida capilar
(CLC), ya que implican un bajo volumen de muestra y un bajo consumo de disolventes
y de generación de residuos, siendo recomendada como una técnica analítica verde.
Además, también se ha investigado el uso de técnicas de alta eficiencia, como la
cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC), ya que ofrece un menor
consumo de disolvente que los métodos LC convencionales, una mayor eficiencia y un
tiempo de análisis más corto. Además de la detección UV-Vis, en esta Tesis se ha
considerado la espectrometría de masas (MS) debido a sus ventajas, como una mayor
sensibilidad y selectividad y su capacidad para identificar inequívocamente un gran
número de compuestos. Por último, se ha evaluado el acoplamiento de la espectrometría
de movilidad iónica (IMS) al flujo de trabajo LC acoplado a espectrometría de masas de
alta resolución (LC-HRMS), ya que proporciona información complementaria mediante
el parámetro denominado sección transversal de colisión (CCS) que puede derivarse de dicha técnica. Al mismo tiempo, se han investigado métodos de tratamiento de muestra
para lograr la extracción y preconcentración de los analitos de manera adecuada.
Cabe destacar que en esta Tesis se ha intentado llevar a cabo aportaciones novedosas
explorando metodologías alternativas a las convencionales para abordar estos
problemas. Así, se ha desarrollado la primera aplicación de la electroforesis capilar en la
determinación de fipronil y sus metabolitos en muestras de huevo. Además, se aborda
por primera vez la determinación conjunta de cianotoxinas de diversas familias y por
tanto con características físico-químicas muy diferentes y la caracterización en términos
de CCS de un gran número de cianotoxinas empleando movilidad iónica de onda viajera
(TWIMS) acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con analizador de
cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF-HRMS).
Esta Tesis se ha dividido en dos partes diferenciadas. La Parte I presenta una
introducción que incluye aspectos relevantes relacionados con los insecticidas objeto de
estudio y recopila el trabajo experimental desarrollado. En esta parte se incluyen los
siguientes capítulos:
• El Capítulo 1 describe un método basado en CE en su modo de cromatografía
electrocinética micelar (MEKC) con detección por batería de diodos (DAD) como
un enfoque novedoso para la determinación de fipronil y su principal metabolito,
fipronil-sulfona en muestras de huevos de gallina. Con este fin se desarrolló un
tratamiento de muestra basado en la extracción líquido-líquido asistida por sales
(SALLE) para extraer eficientemente los analitos.
• El Capítulo 2 trata del empleo de la CLC acoplada a DAD como técnica
miniaturizada para la separación y determinación de fipronil y dos de sus
principales metabolitos, fipronil-sulfona y fipronil-sulfuro, en muestras de huevos de gallina. SALLE fue la técnica de extracción empleada para extraer los
analitos diana de la matriz de interés.
Por otro lado, en la Parte II se ofrece una introducción con información de interés sobre
las cianobacterias, cianotoxinas y métodos de análisis, así como los métodos
desarrollados en esta Tesis para dichos analitos. En esta parte se encuentran los
siguientes capítulos:
• El Capítulo 3 incluye un estudio exhaustivo de la determinación de cianotoxinas
de diferentes familias en muestras de agua de embalses mediante cromatografía
líquida de interacción hidrofílica (HILIC) acoplada a detección MS en tándem
(MS/MS). Para lograr la extracción simultánea de los analitos se desarrolló un
novedoso método de tratamiento de muestra basado en la extracción en fase
sólida (SPE) en tándem.
• El Capítulo 4 consiste en el desarrollo de un método basado en HILIC-MS/MS
para la determinación de cianotoxinas de diferentes familias en suplementos
dietéticos basados en cianobacterias. Se empleó un tratamiento de muestra basado
en extracción sólido-líquido (SLE) seguido de una SPE en tándem. El método se
aplicó a diferentes muestras de suplementos dietéticos para estudiar la presencia
de cianotoxinas y evaluar el riesgo potencial para la salud.
• El Capítulo 5 presenta la investigación realizada bajo la supervisión de las
profesoras Dra. Laura Righetti y Dra. Chiara Dall’Asta durante la estancia de
investigación predoctoral en la Universidad de Parma (Parma, Italia). El trabajo
consistió en el desarrollo de una base de datos de CCS como un parámetro
complementario para la caracterización de 20 cianotoxinas y una biotoxina
marina empleando un método de movilidad iónica de onda viajera acoplado a
espectrometría de masas de cuadrupolo-tiempo de vuelo (TWIMS-QTOF-MS). Se discutieron los resultados obtenidos y posteriormente se llevó a cabo un cribado
de cianotoxinas en varias muestras de suplementos dietéticos para evaluar su
presencia.