Functional mass cytometry for reclassification and precise diagnosis of systemic autoimmune diseases

Abstract

El lupus eritematoso sistémico (LES), la artritis reumatoide (AR), la esclerosis sistémica (SSC), el síndrome de Sjögren (SSJ), la enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) y el síndrome antifosfolípido primario (PAPS) se clasifican como enfermedades autoinmunes sistémicas (EAS o SAD en inglés). Estas enfermedades se caracterizan por signos de autoinmunidad que incluyen la producción de autoanticuerpos y el daño a diferentes órganos. Aunque tienen definiciones clínicas y criterios de diagnóstico clínico separados, estas enfermedades son difíciles de diagnosticar de manera diferencial, ya que los pacientes tienen síntomas muy superpuestos y signos clínicos variados, particularmente en las primeras etapas de la enfermedad. Este panorama clínico superpuesto impide el diagnóstico correcto y la administración temprana de fármacos. Si bien durante mucho tiempo se sospechó de la semejanza molecular entre las EAS, la falta de biomarcadores compartidos bien descritos dificulta el tratamiento y el diagnóstico. Por tanto, es necesario realizar estudios moleculares y celulares para clasificar a los pacientes en función del mecanismo fisiopatológico subyacente en una estrategia de medicina personalizada. Para estudiar la complejidad del sistema inmunológico a nivel de una sola célula, es necesario utilizar tecnologías adecuadas. La citometría de masas (Citometría por tiempo de vuelo, CyTOF, CM) es una técnica de alta dimensión que permite medir más de 50 marcadores en una sola célula. Por lo tanto, es una buena herramienta para realizar estudios de fenotipado profundo rastreando varios tipos de células o niveles de marcadores de activación celular. Sin embargo, para observar los patrones celulares específicos del paciente, es necesario reclutar números importantes de individuos, lo que a menudo involucra a diferentes centros de investigación. Por tanto, es necesario establecer un diseño experimental adecuado. La preservación de sangre completa es una forma atractiva de recolectar muestras de centros ubicados lejos de las instalaciones del centro donde se realiza la CM, sin embargo, hasta ahora no se han validado suficientes protocolos de preservación de sangre para CM. Además, debido a que las muestras adquiridas a través del instrumento CyTOF sufren obstrucción por el material celular así como caída de señal asociada a adquisiciones prolongadas y efectos de lote, se debe tener especial cuidado al analizar los datos cuando se estudian múltiples grupos de muestras. Por lo tanto, es necesario utilizar un flujo de análisis de datos que considere la normalización de datos, el control de calidad y la naturaleza de alta dimensión de los datos de CM. Además, para analizar cientos de muestras, el flujo de análisis debe adaptarse para estudios a gran escala e idealmente debe automatizarse tanto como sea posible. Sin embargo, hasta ahora, no se ha desarrollado tal flujo de trabajo con esas características. En esta tesis doctoral hemos estudiado 7 EAS diferentes con el fin de encontrar nuevos biomarcadores que permitan la reclasificación de pacientes según firmas de leucocitos circulan tes. Nuestro objetivo fue realizar un estudio de fenotipado profundo que incluya marcadores funcionales relevantes para las EAS. Como queríamos tener la imagen más completa del sistema inmunológico, decidimos recolectar muestras de sangre completa y usar citometría de masas para analizarlas. Para ello realizamos la recogida de muestras de sangre en diferentes centros ubicados en Granada y Córdoba. Por tanto, tuvimos que establecer un protocolo de criopreservación adecuado para estudios multicéntricos. Como en total se recolectaron más de cien muestras, también establecimos un protocolo experimental que minimiza la variación experimental, y se optimizó un proceso de análisis y control de calidad junto con el preprocesamiento de datos automatizado. Utilizando estos ajustes, hemos demostrado que los estudios de inmunofenotipificación de alto contenido se pueden realizar con éxito con pequeñas cantidades de sangre fijada / congelada. La fijación inmediata de sangre completa se beneficia de tiempos de manipulación más cortos, lo que evita la muerte celular, especialmente en el compartimento de neutrófilos. Diseñamos un flujo de trabajo experimental que limita la variación experimental y reportamos un flujo de trabajo de curación de datos basado en R que limpia los datos recolectados y corrige los efectos por lotes introducidos durante la preparación y tinción de la muestra. Este flujo está semiautomatizado y optimizado para estudios grandes que involucran fenotipado de sangre humana, junto con marcadores funcionales. Finalmente, demostramos que CM se puede utilizar con éxito para detectar grupos (clusters) de pacientes que tienen patrones inmunes similares, lo que respalda el desarrollo de la medicina personalizada en las EAS. Hemos construido un marco de reclasificación de pacientes utilizando frecuencias celulares y niveles de expresión de marcadores funcionales. Los cuatro grupos de pacientes identificados difieren en la frecuencia y el estado de activación de células mieloides y linfoides. Además, también se caracterizaron por diferentes niveles de citoquinas pro- y antiinflamatorias. Cada grupo contiene una mezcla de diferentes enfermedades, lo que confirma la alta heterogeneidad de cada etiqueta diagnóstica.

Systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), systemic sclerosis (SSC), Sjögren’s syndrome (SJS), mixed connective tissue disease (MCTD) and primary antiphospholipid syndrome (PAPS) are classified as systemic autoimmune diseases (SADs). These diseases are characterized by signs of autoimmunity that include the production of autoantibodies and the damage of different organs. Although having separated clinical definitions and clinical diagnostic criteria, these diseases are difficult to diagnose differentially, as patients have highly overlapping symptoms and varied clinical signs, particularly at early disease stages. This overlapping clinical landscape impedes the correct diagnosis and early drug administration. While molecular resemblance between SADs was suspected for a long time, the lack of well described, shared biomarkers makes treatment and diagnosis difficult. Therefore, molecular and cellular-based studies need to be undertaken to classify the patients based on the physiopathological mechanism underlying the diseases in an strategy of personalized medicine. In order to study the complexity of the immune system at the single cell level, proper technologies need to be used. Mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF, MC) is a high-dimensional technique that allows to measure more than 50 markers in one single cell. Thus, it is a good tool to perform deep-phenotyping studies tracking several cell types or levels of cellular activation markers. However, in order to observe patient-specific cellular patterns, significant amounts of individuals need to be recruited, involving often different research centers. Hence a proper experimental design needs to be established. Whole blood preservation seems to be an attractive way to gather samples from centers located far away from MC-core facility, yet not many blood-preservation protocols were validated for MC so far. Additionally, because samples acquired through the CyTOF instrument suffer from cell clogging, signal drop associated to long acquisition and batch effects, special care needs to be taken when analyzing the data when multiple groups of samples are studied. Thus, a data analysis pipeline that considers data normalization, quality control and the high-dimensional nature of MC data needs to be used. Additionally, in order to analyze hundreds of samples the analysis pipeline needs to be adapted for large-scale studies and ideally be automatized as much as possible. However up to now, no such workflow was developed. In this PhD thesis we studied 7 different SADs in order to find new biomarkers that allow for patient reclassification according to immune cell signatures. We aimed at performing a deep phenotyping study including functional markers relevant for SADs. As we wanted to have the most complete picture of the immune system we decided to collect whole blood samples and use MC cytometry to analyze them. In order to do this we collected blood samples in different centers located in Granada and Córdoba. Thus, we had to establish a cryopreservation protocol suitable for multicenter studies. As in total more than one hundred samples were collected, we established also an experimental protocol minimizing experimental variation, and a quality control and analysis pipeline was also optimized together with automatized data preprocessing. Using these settings we have demonstrated that high-content immunophenotyping studies can be successfully performed with small amounts of fixed/frozen blood. Immediate whole blood fixation benefits from shorter manipulation times, hence preventing cell death specially in the neutrophil compartment. We designed an experimental workflow that limits experimental variation and reported an R-based data curation workflow that cleans collected data and corrects the batch effects introduced during the sample preparation and staining. This pipeline is semi-automated and optimized for large studies involving human blood phenotyping, together with functional markers. Finally, we showed that MC can be successfully used to detect groups (clusters) of patients having similar immune landscapes, supporting the personalized medicine development in SADs. So far, we constructed a patient reclassification framework using cell frequencies and expression levels of functional markers. The four detected clusters differed in the frequency and activation state of both myeloid and lymphoid cells. Additionally, they were also characterized by different levels of pro and antiinflammatory cytokines. Each cluster contained a mixture of different diseases, confirming the high heterogeneity of each diagnosis label.