La cuantificación como herramienta de optimización en el análisis de ADN mitocondrial en restos óseos antiguos

Abstract

El análisis de ADN mitocondrial en restos óseos antiguos tiene multitud de aplicaciones como son la identificación humana, los estudios poblacionales, o la identificación de especies no humanas, sumándose su interés al del análisis de restos óseos antiguos: desaparición de personas, víctimas de atentados terroristas, víctimas de grandes catástrofes, restos de fosas comunes en conflictos bélicos, litigios de filiación o las adopciones irregulares. No obstante, el análisis no está exento de problemas técnicos que impiden la obtención de un resultado, como son fundamentalmente la degradación del ADN, proceso natural tras la muerte que se ve acentuado en muchas ocasiones por la acción de microorganismos, sustancias, o factores como el pH o la temperatura; y la inhibición de la actividad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) motivada por sustancias que causan dicha inhibición. El presente trabajo pretende diseñar un experimento para mostrar la utilidad de la realización de una cuantificación del ADN mitocondrial inmediata a la extracción para, mediante PCR a tiempo real, determinar la cantidad de ADN mitocondrial presente y el estado de degradación del mismo, y así establecer la vía analítica más favorable para la obtención de un resultado. Para ello, se van a degradar muestras de ADN genómico con nucleasas en diluciones seriadas y a distintos intervalos de tiempo para, posteriormente, cuantificar dos fragmentos, uno corto y uno largo, de la región del 16S rRNA, obteniendo al mismo tiempo información sobre la cantidad y la calidad.

Mitochondrial DNA analysis in skeletal remains has multiple applications like human identification, population studies, or non-human species identification, adding it interest to ancient skeletal remains analysis: missing people, terrorist attacks victims, disaster victim identification, armed conflict potter’s field, filiation legal cases, or irregular adoptions. However, analysis is not exempt of technical problems which impede obtaining any result, we are talking about DNA degradation, a natural process after organism death which is increased by the action of microorganisms, some substances or the action of factors like pH or temperature; and PCR inhibition, motivated by some substances. The present work aims to show the utility of the realization of a mitochondrial DNA quantification immediately after extraction in order to, by real time PCR, determining the present mitochondrial DNA quantity and how degraded it is, so we can choose the most favorable analytical step in order to get any result. To achieve that we are going to design an experiment in which we are going to artificially degrade genomic DNA with DNases in serial dilutions in different time lapses and then we will quantify it in two fragments, one longer one shorter, from 16S rRNA region, obtaining information about mitochondrial DNA quantity and quality.