Expresión de metaloproteasas en células madre tumorales mamarias tras irradiación

Abstract

INTRODUCTION: The CSCs constitute a small sub-population of cells in the tumor. They are characterized by their capacity for self-renewal, differentiation, metastasis, quiescence, tumorigenesis, survival in the blood stream, expression of surface markers, and resistance to chemotherapy and radiotherapy. Ionizing radiation treatment causes senescence, genomic and epigenetic instability, metabolism and cell cycle changes, DNA damage, modified DNA repair capacity, and CSC death. CSCs surviving radiation treatment generate survival mechanisms that enhance their invasion and metastasis processes. Different types of metalloproteinase (MMP) intervene in these processes. MMPs are family of endopeptidases secreted as zymogens by cells in the tumor and microenvironment. They are also implicated in other aspects of carcinogenesis such as EMT, tumor growth, apoptosis evasion, angiogenesis, inflammatory response, and pre-metastatic niche formation. These enzymes are regulated by TIMPs and, epigenetically, by HDACs. OBJECTIVE: To establish the proportion of CSCs in two human breast cancer cell lines after different radiation doses, and to determine CSC expression of different enzymes related to the tumor microenvironment (MMPs, TIMPs and HDACs) in the positive and negative CSC populations. MATERIAL AND METHODS: Two breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231) were maintained in monolayer culture and then cultured in sphere medium. At 24 h after seeding in monolayer, cells were irradiated at 2, 4 or 6 Gy, maintaining a non-irradiated control. Cells were then cultured for 7 days to form colonies, followed by flow cytometry studies to measure stem cell markers (ALDH1, CD24 and CD44). From the general population of cells cultured in sphere media, positive and negative CSCs were separated with flow cytometry. The two cell sub-populations were irradiated at doses of 0, 2, 4, or 6 Gy. After 24 hours of irradiation, RT-PCR was used for RNA extraction and quantification and cDNA synthesis, and qPCR for gene expression measurement. The genes measured in both positive and negative sub-populations were: MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-4, TIMP-1 and TIMP-2. RESULTS: After ionizing radiation treatment, the proportion of CSCs markers varied according to the dosage and cell type. ALDH positivity was increased at 4 Gy in MCF-7 cells, while ALDH1 and CD44 were increased at 6 Gy in the MDA-MB-231 line. More genes were expressed in the MDA-MB-231 versus MCF-7 line. MMP-1, MMP-2, HDAC-4, and TIMP-1 genes were expressed in both cell lines. MMP-3, MMP-9, MMP-13, HDAC-2 and TIMP-2 were also expressed In MDA-MB-231 cells. In general, genes were more expressed in the negative population than in the positive, highlighting the positive CSCs expression of MMP-2 and MMP-9, which are relarelated to the formation of secondary tumors. CONCLUSIONS: Radiation enhances the population of CSCs in different ways according to the dose and cell line. Post-radiation, a larger number and higher proportion of genes were expressed in the MDA-MB-231 cell line, which is more radioresistant in comparison to MCF-7. The increased MMP-2 and MMP-9 expression after radiation would contribute to modifying the cell survival capacity and differentiation status of MDA-MB-231 cells and may correspond to a phenotype linked to carcinogenesis. The increase in this expression with higher radiation dose in the positive CSC population may play a role in the development of secondary tumors, facilitating ECM degradation by the cells that survive radiation. Administration of inhibitors of these MMPs to patients undergoing radiotherapy may be useful to avoid the radiation-induced development of a more aggressive phenotype that promotes tumor progression. Both MMP-2 and MMP-9 may be considered novel therapeutic targets in cancer treatment.

INTRODUCCIÓN: Las CSCs constituyen una pequeña subpoblación de células dentro del tumor. Estas células se caracterizan por la capacidad de auto-renovación, diferenciación, metástasis, quiescencia, tumorigénesis, supervivencia al torrente sanguíneo, expresión de marcadores de superficie y resistencia a la quimioterapia y radioterapia. El tratamiento con radiación ionizante provoca en las CSCs senescencia, inestabilidad genómica y epigenética, alteración del metabolismo y del ciclo celular, daño en el ADN y modificación de su reparación, y muerte celular. Las CSCs que sobreviven al tratamiento con radiación generan mecanismos de supervivencia que les permite favorecer los procesos de invasión y metástasis, en los que también intervienen distintos tipos de metaloproteasas (MMP s). Las MMPs son una familia de endopeptidasas, secretadas como zimógenos tanto por las células tumorales como por las células del microambiente. Están además implicadas en otros procesos de la carcinogénesis como la TEM, el crecimiento tumoral, la evasión de la apoptosis, la angiogénesis, la inflamación, y la formación de nichos pre-metastásicos. Estas enzimas estám reguladas por los TIMPs y, epigenéticamente, por las HDACs. OBJETIVO: Establecer la proporción de CSCs en dos líneas celulares tumorales de cáncer de mama humano para distintas dosis de radiación y, determinar, en caso de que exista, la expresión de distintas enzimas asociadas al microambiente tumoral (MMPs, TIMPs y HDACs) en las poblaciones CSCs positiva y negativa. RESULTADOS: Tras el tratamiento con radiación ionizante, el porcentaje de marcadores de CSCs varía en función de la dosis y del tipo celular. En MCF-7 se observa un incremento de ALDH1 a los 4 Gy, mientras que en MDA-MB-231, aumentan los marcadores ALDH1 y CD44 a los 6 Gy. Se han expresado mayor número de genes en la línea MDA-MB-231 que en la MC F-7. Los genes expresados en ambas líneas han sido: MMP-1, MMP-2, HDAC-4 y TIMP-1. En MDA-MB-231, además, se han expresado la MMP-3, MMP-9, MMP-13, HDAC-2 y TIMP-2. De forma general, los genes han sido más expresados en la población negativa que en la positiva, destacando la expresión en las CSCs positivas de la MMP-2 y la MMP-9, las cuales están relacionadas con la formación de tumores secundarios. CONCLUSIONES: La radiación favorece la selección de CSCs de distinta manera dependiendo de la dosis y de la línea celular irradiada. Además, después de este tratamiento, mayor número de genes y en mayor proporción han sido expresados en la línea celular MDA-MB-231, la cual es más radio-resistente que la MCF-7. La expresión aumentada de MMP-2 y MMP-9 tras el tratamiento con radiación estaría contribuyendo, por tanto, a que las células MDA-MB-231 modifiquen su capacidad de supervivencia celular, su estado de diferenciación y a que reflejen un fenotipo asociado al proceso de carcinogénesis. El hecho de que esta expresión aumente con la dosis de radiación en la población CSC+, podría justificar el desarrollo de tumores secundarios, dado que aquellas células que no han sido eliminadas con radiación degradarían la MEC con mayor facilidad. En este sentido, sería interesante utilizar, junto a la radioterapia, inhibidores de estas MMPs para evitar que, tras el empleo de radiación, las células desarrollaran un fenotipo más agresivo que favorezca la progresión tumoral. De esta manera, tanto MMP-2 como MMP-9 podrían ser consideradas como nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento del cáncer.