Valor clínico de la caracterización de células tumorales circulantes y análisis molecular de tejido en estadios iniciales de cáncer de pulmón no microcítico

Abstract

Introducción El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer a nivel mundial(1). El carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) es el subtipo histológico más frecuente, suponiendo un 80% de los casos, y es subsidiario de tratamiento quirúrgico de elección en estadios resecables (I-III)(2). A pesar de la cirugía, la tasa de recidiva es mayor de lo deseable y oscila entre el 30-35% ocurriendo en la mayoría de los casos de forma precoz en los primeros 5 años, debido principalmente a la enfermedad mínima residual(3). De la misma manera, la supervivencia global es inferior al 15-20% a los 5 años(4). La compleja heterogeneidad tumoral intra e inter paciente y la gran variabilidad pronóstica de esta patología nos hace preguntarnos qué factores y biomarcadores son responsables de estas diferencias. Las células tumorales circulantes (CTCs) son analitos derivados del tumor primario y pueden detectarse en sangre periférica. Se asocian al proceso metastásico, considerándose como un potencial factor pronóstico(5)(6). Las CTCs son muy heterogéneas, pudiendo existir diferentes subpoblaciones en un mismo paciente(7), por lo que su caracterización fenotípica y/o molecular aporta más información acerca de la biología tumoral. La secuenciación de nueva generación (NGS) facilita paneles genéticos personalizados para un análisis molecular más exhaustivo del tipo tumoral, permitiendo analizar multitud de genes y alteraciones en una misma muestra(8). El objetivo principal de esta tesis es analizar el valor pronóstico de marcadores de biopsia líquida junto al análisis molecular del tejido y las posibles ventajas de su análisis combinado como fuentes de información biológica tumoral en pacientes con estadios iniciales de CPNM tratados quirúrgicamente. Los objetivos específicos son: 1) Detección y caracterización fenotípica de CTCs, en concreto de la proteína EZH2 (miembro del complejo de represión Polycomb 2), 2) Análisis molecular tumoral mediante un perfil mutacional personalizado de 50 genes implicados en distintos procesos biológicos, y 3) Análisis entre la caracterización molecular tisular y las CTCs y su valor pronóstico. En este contexto, hipotetizamos que la detección de este subtipo de CTCs-EZH2 en combinación con mutaciones tumorales específicas podrían contribuir como biomarcadores pronósticos e indicadores de enfermedad mínima residual en CPNM, orientando las posibles estrategias de tratamiento postoperatorio. Material y Métodos Se trata de una cohorte observacional prospectiva de pacientes con CPNM en estadios I-III tratados con cirugía radical como primera opción de tratamiento entre julio de 2017 y diciembre de 2019. Se realizaron dos determinaciones sanguíneas para el aislamiento de CTCs y su posterior caracterización en base a la expresión de EZH2, la primera antes de la intervención (CTC1) y otra al mes de esta (CTC2). En el acto quirúrgico, se extrajo una muestra del tejido tumoral para su secuenciación mediante NGS utilizando un panel personalizado de 50 genes. Para el aislamiento de CTCs se usó la metodología MACs® y para su caracterización fenotípica el anticuerpo anti-EZH2. El ADN tumoral se extrajo utilizando el kit NucleoSpin®Tissue y su secuenciación se realizó mediante NGS utilizando un panel personalizado de 50 genes. Resultados Se incluyeron un total de 76 pacientes para estudio de biopsia líquida y un subgrupo de 23 pacientes para estudio tisular, realizándose un seguimiento durante 5 años. El 60,5% de la serie fueron varones con una edad media de 67 años y hábito tabáquico en el 81%. El subtipo histológico adenocarcinoma fue el más frecuente (65,8%) y la lobectomía fue el principal tipo de resección pulmonar (77,6%). La carga de CTCS detectadas disminuyó de forma significativa tras la cirugía (p < 0,0001), y los pacientes con CTCs y alta expresión de EZH2 (≥70%) presentaron mayor riesgo de muerte (p = 0,018). Los genes con mayor frecuencia de mutación fueron TP53, FLT1, MUC5AC, EGFR y NLRP3. El análisis molecular reveló cinco pares de genes con mutaciones coocurrentes de significación estadística: CD163–TLR4 (p = 0,0056), FGF10–FOXP2 (p = 0,0118), ADAMTSL3–FLT1 (p = 0,0142), ADAMTSL3–MUC5AC (p = 0,0144), y MUC5AC– NLRP3 (p = 0,0183), así como una única interacción genética mutuamente excluyente, también con significación estadística: RIN3 y TP53 (p = 0,0457). La agrupación de variantes con significado clínico patogénico con aquellas de significado incierto (VUS) supuso una mayor carga mutacional en los pacientes que presentaron recurrencia (p = 0.0404). Discusión La secuenciación de nueva generación (NGS) ofrece un panel genético personalizado para un conocimiento molecular más exhaustivo del tipo tumoral. La medicina de precisión utiliza la NGS para identificar la heterogeneidad tumoral, predecir la evolución de la enfermedad y permitir orientar líneas de tratamiento según el potencial riesgo de recidiva. Nuestro estudio seleccionó un panel personalizado de 50 genes participantes en distintos procesos biológicos (desarrollo embriológico, relacionados con la EPOC, inflamación y proliferación tumoral), analizándose la interacción entre ellos. En nuestro análisis molecular el gen más frecuentemente mutado fue TP53, observándose principalmente en estadios patológicos localmente avanzados (estadio III). Respecto a las interacciones genéticas, se observaron 5 mutaciones coocurrentes con significación estadística: CD163- TLR4, FGF10-FOXP2, ADAMTSL3-FLT1, ADAMTSL3-MUC5AC y MUC5AC-NLRP3, así como una excluyente: RIN3-TP53. Estas interacciones sugieren posibles rutas convergentes implicadas en el desarrollo tumoral, así como rutas alternativas de trasformación tumoral, respectivamente. La biopsia líquida es otra herramienta que posibilita el análisis de biomarcadores originarios del tumor, como las células tumorales circulantes (CTCs), facilitando igualmente información más detallada del tumor y en tiempo real. Su detección y análisis de su dinámica permite una monitorización de la enfermedad. En nuestro estudio observamos una dinámica descendente entre la detección preoperatoria (CTC1) y postoperatoria (CTC2), siendo este descenso significativo. La negativización de CTCs postoperatoria podría asociarse positivamente al pronóstico, mientras que la persistencia implicaría persistencia de enfermedad (enfermedad mínima residual) a pesar de la cirugía. Además, la caracterización fenotípica y molecular de estas células aporta información más precisa de las distintas subpoblaciones. En nuestra serie, elegimos la expresión de EZH2 por su implicación pronóstica en determinados tipos de cánceres, incluido en el CPNM y observamos que niveles de expresión de EZH2 ≥70% se relacionaron con mayor riesgo de muerte y peor SG. La expresión de EZH2 podría reflejar mayor agresividad en subpoblaciones celulares desprendidas del tumor primario, considerándose un marcador de mal pronóstico. Conclusiones La integración del perfil molecular tumoral junto con la caracterización de CTCs brinda una visión más integral y dinámica de la heterogeneidad tumoral. Esta información combinada y complementaria posibilita una estratificación del riesgo de recidiva y/o desarrollo de metástasis, ayudando a la toma de decisiones terapéuticas. Además, permite una monitorización en tiempo real de la enfermedad, siendo clave para una medicina moderna más personalizada.

Introduction Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide(1). Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the most common histological subtype, comprising 80% of all cases, and the only one eligible for surgical treatment in resectable stages (I-III)(2). Despite surgical resection, relapse rates are unacceptably high, ranging from 30–35% and early in the first 5 years, mainly due to minimal residual disease(3). with a 5‐year rate overall survival of 15-20%(3). The complex tumor heterogeneity in the same patient and between patients, combined with an uncertain prognostic variability of this disease, raises the question of which factors and biomarkers are responsible for these differences. Circulating tumor cells (CTCs) are analytes derived from the primary tumor and can be detected in peripheral blood. They are related to the metastatic process as a potential prognostic factor(4)(5). CTCs are highly heterogeneous and different subpopulations may exist in the same patient(6). Phenotypic and molecular characterization of CTCs provides additional information about tumor biology. Next-generation sequencing (NGS) facilitates personalized genetic panels for a more exhaustive molecular analysis of tumor type. The analysis of multiple genes and alterations can be done in a single sample(7). The main objective of this thesis is to analyze the prognostic value of liquid biopsy markers and the molecular tissue analysis, as well as their potential combined analysis advantages as sources of tumor biological information in patients with early stages of NSCLC treated with radical surgery. The specific objectives are the following: 1) Phenotypic characterization of CTCs, specifically the EZH2 protein (a member of the Polycomb repression complex 2), 2) Molecular tumor analysis using a personalized mutational profile of 50 genes involved in different biological processes, and 3) Analysis between tissue molecular characterization and CTCs and their prognostic value. In this context, we hypothesize that the detection of this subtype of EZH2-CTCs in combination with specific tumor mutations could contribute as prognostic biomarkers and indicators of minimal residual disease in early-stage NSCLC, guiding possible postoperative treatment strategies. Materials and Methods This is a prospective observational cohort of patients with stage I-III NSCLC treated with radical surgery as the first treatment option between July 2017 and December 2019. Two blood samples were collected for CTCs isolation and subsequent EZH2 characterization: one prior to surgery (CTC1) and another one month after resection (CTC2). During surgery, a tumor sample was extracted for targeted NGS sequencing using a customized 50-gene panel, from a subset of patients. The MACs® methodology was used for CTC isolation and the rabbit anti-EZH2 antibody was used for phenotypic characterization. Tumor DNA was extracted using the NucleoSpin® Tissue kit and sequencing was performed using NGS using a customized 50-gene panel. Results A total of 76 patients were included for liquid biopsy analysis and a subgroup of 23 patients for tissue analysis, with a 5-year follow-up. As results, 66% of the series were men, with a mean age of 67 years old and 81% were smokers. The most common histological subtype was adenocarcinoma (65.8%), and lobectomy was the main type of lung resection performed (77.6%). The number of CTCs detected significantly decreased between CTC1 and CTC2 (p < 0.0001) after surgery. CTCs+ patients with high EZH2 expression (≥70%) had a higher risk of death (p = 0.018). The most frequently mutated genes were TP53, FLT1, MUC5AC, EGFR, and NLRP3. Molecular analysis revealed five gene pairs with co-occurring mutations of statistical significance: CD163–TLR4 (p = 0.0056), FGF10–FOXP2 (p = 0.0118), ADAMTSL3– FLT1 (p = 0.0142), ADAMTSL3–MUC5AC (p = 0.0144), and MUC5AC–NLRP3 (p = 0.0183), as well as a single mutually exclusive genetic interaction: RIN3 and TP53 (p = 0.0457). Grouping pathogenic clinical variants with those of uncertain significance (VUS) revealed a higher mutational burden in patients who experienced recurrence (p = 0.0404). Discussion Next-generation sequencing (NGS) enables comprehensive molecular analysis of tumors through customized gene panels. Precision medicine uses NGS to identify tumor heterogeneity, predict disease progression, and guide treatment options based on the potential risk of recurrence. In our study, we selected a personalized panel of 50 genes involved in distinct biological processes (embryological development, COPD-related processes, inflammation, and tumor proliferation), analyzing their interaction, both cooccurring and mutually exclusive events, and their relationship with prognosis. In our molecular analysis, the most frequently mutated gene was TP53, observed mainly in locally advanced disease stages (stage III). Regarding genetic interactions, five co-occurring mutations with statistical significance were observed: CD163-TLR4, FGF10-FOXP2, ADAMTSL3-FLT1, ADAMTSL3-MUC5AC, and MUC5AC-NLRP3, as well as one exclusive mutation: RIN3-TP53. These interactions suggest possible convergent pathways involved in tumor development and pathways of tumor transformation, respectively. Liquid biopsy is a valuable tool for detecting tumor-derived biomarkers such as circulating tumor cells (CTCs), providing more precise real-time information about the tumor. Its detection and its dynamics analysis allow disease monitoring. In our study, we observed a significant decrease in the number of CTCs because of the surgery. The absence of postoperative CTCs could be positively associated with prognosis, while persistence would imply disease persistence (minimal residual disease) despite surgery. Furthermore, the phenotypic and molecular characterization of these cells provides more precise information about the different subpopulations. In our study, we selected the protein EZH2 due to its prognostic implications in certain types of cancer, including NSCLC, and we observed that EZH2 expression levels ≥70% were associated with a higher risk of death and worse OS. EZH2 expression could reflect greater aggressiveness in cell subpopulations detached from the primary tumor and is considered a marker of poor prognosis. Conclusions Integrating the molecular profile of tumors and CTCs characterization provides a more comprehensive and dynamic view of tumor heterogeneity. This combined approach enables risk stratification of recurrence and/or metastasis development, aiding therapeutic decision-making. It also enables real-time disease monitoring, which is key to more personalized modern medicine.