@misc{10481/108860,
year = {2025},
url = {https://hdl.handle.net/10481/108860},
abstract = {Introducción
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer a nivel mundial(1). El
carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) es el subtipo histológico más frecuente,
suponiendo un 80% de los casos, y es subsidiario de tratamiento quirúrgico de elección en
estadios resecables (I-III)(2). A pesar de la cirugía, la tasa de recidiva es mayor de lo
deseable y oscila entre el 30-35% ocurriendo en la mayoría de los casos de forma precoz en
los primeros 5 años, debido principalmente a la enfermedad mínima residual(3). De la
misma manera, la supervivencia global es inferior al 15-20% a los 5 años(4). La compleja
heterogeneidad tumoral intra e inter paciente y la gran variabilidad pronóstica de esta
patología nos hace preguntarnos qué factores y biomarcadores son responsables de estas
diferencias.
Las células tumorales circulantes (CTCs) son analitos derivados del tumor primario y
pueden detectarse en sangre periférica. Se asocian al proceso metastásico, considerándose
como un potencial factor pronóstico(5)(6). Las CTCs son muy heterogéneas, pudiendo
existir diferentes subpoblaciones en un mismo paciente(7), por lo que su caracterización
fenotípica y/o molecular aporta más información acerca de la biología tumoral. La
secuenciación de nueva generación (NGS) facilita paneles genéticos personalizados para un
análisis molecular más exhaustivo del tipo tumoral, permitiendo analizar multitud de genes
y alteraciones en una misma muestra(8).
El objetivo principal de esta tesis es analizar el valor pronóstico de marcadores de biopsia
líquida junto al análisis molecular del tejido y las posibles ventajas de su análisis combinado
como fuentes de información biológica tumoral en pacientes con estadios iniciales de CPNM
tratados quirúrgicamente. Los objetivos específicos son: 1) Detección y caracterización
fenotípica de CTCs, en concreto de la proteína EZH2 (miembro del complejo de represión
Polycomb 2), 2) Análisis molecular tumoral mediante un perfil mutacional personalizado de
50 genes implicados en distintos procesos biológicos, y 3) Análisis entre la caracterización
molecular tisular y las CTCs y su valor pronóstico. En este contexto, hipotetizamos que la
detección de este subtipo de CTCs-EZH2 en combinación con mutaciones tumorales
específicas podrían contribuir como biomarcadores pronósticos e indicadores de
enfermedad mínima residual en CPNM, orientando las posibles estrategias de tratamiento
postoperatorio.
Material y Métodos
Se trata de una cohorte observacional prospectiva de pacientes con CPNM en estadios I-III
tratados con cirugía radical como primera opción de tratamiento entre julio de 2017 y
diciembre de 2019.
Se realizaron dos determinaciones sanguíneas para el aislamiento de CTCs y su posterior
caracterización en base a la expresión de EZH2, la primera antes de la intervención (CTC1)
y otra al mes de esta (CTC2). En el acto quirúrgico, se extrajo una muestra del tejido tumoral
para su secuenciación mediante NGS utilizando un panel personalizado de 50 genes. Para el aislamiento de CTCs se usó la metodología MACs® y para su caracterización
fenotípica el anticuerpo anti-EZH2. El ADN tumoral se extrajo utilizando el kit
NucleoSpin®Tissue y su secuenciación se realizó mediante NGS utilizando un panel
personalizado de 50 genes.
Resultados
Se incluyeron un total de 76 pacientes para estudio de biopsia líquida y un subgrupo de 23
pacientes para estudio tisular, realizándose un seguimiento durante 5 años. El 60,5% de la
serie fueron varones con una edad media de 67 años y hábito tabáquico en el 81%. El
subtipo histológico adenocarcinoma fue el más frecuente (65,8%) y la lobectomía fue el
principal tipo de resección pulmonar (77,6%).
La carga de CTCS detectadas disminuyó de forma significativa tras la cirugía (p < 0,0001), y
los pacientes con CTCs y alta expresión de EZH2 (≥70%) presentaron mayor riesgo de
muerte (p = 0,018). Los genes con mayor frecuencia de mutación fueron TP53, FLT1,
MUC5AC, EGFR y NLRP3. El análisis molecular reveló cinco pares de genes con mutaciones
coocurrentes de significación estadística: CD163–TLR4 (p = 0,0056), FGF10–FOXP2 (p =
0,0118), ADAMTSL3–FLT1 (p = 0,0142), ADAMTSL3–MUC5AC (p = 0,0144), y MUC5AC–
NLRP3 (p = 0,0183), así como una única interacción genética mutuamente excluyente,
también con significación estadística: RIN3 y TP53 (p = 0,0457). La agrupación de variantes
con significado clínico patogénico con aquellas de significado incierto (VUS) supuso una
mayor carga mutacional en los pacientes que presentaron recurrencia (p = 0.0404).
Discusión
La secuenciación de nueva generación (NGS) ofrece un panel genético personalizado para
un conocimiento molecular más exhaustivo del tipo tumoral. La medicina de precisión
utiliza la NGS para identificar la heterogeneidad tumoral, predecir la evolución de la
enfermedad y permitir orientar líneas de tratamiento según el potencial riesgo de recidiva.
Nuestro estudio seleccionó un panel personalizado de 50 genes participantes en distintos
procesos biológicos (desarrollo embriológico, relacionados con la EPOC, inflamación y
proliferación tumoral), analizándose la interacción entre ellos. En nuestro análisis
molecular el gen más frecuentemente mutado fue TP53, observándose principalmente en
estadios patológicos localmente avanzados (estadio III). Respecto a las interacciones
genéticas, se observaron 5 mutaciones coocurrentes con significación estadística: CD163-
TLR4, FGF10-FOXP2, ADAMTSL3-FLT1, ADAMTSL3-MUC5AC y MUC5AC-NLRP3, así como una
excluyente: RIN3-TP53. Estas interacciones sugieren posibles rutas convergentes
implicadas en el desarrollo tumoral, así como rutas alternativas de trasformación tumoral,
respectivamente.
La biopsia líquida es otra herramienta que posibilita el análisis de biomarcadores
originarios del tumor, como las células tumorales circulantes (CTCs), facilitando igualmente
información más detallada del tumor y en tiempo real. Su detección y análisis de su dinámica permite una monitorización de la enfermedad. En nuestro estudio observamos una
dinámica descendente entre la detección preoperatoria (CTC1) y postoperatoria (CTC2),
siendo este descenso significativo. La negativización de CTCs postoperatoria podría
asociarse positivamente al pronóstico, mientras que la persistencia implicaría persistencia
de enfermedad (enfermedad mínima residual) a pesar de la cirugía. Además, la
caracterización fenotípica y molecular de estas células aporta información más precisa de
las distintas subpoblaciones. En nuestra serie, elegimos la expresión de EZH2 por su
implicación pronóstica en determinados tipos de cánceres, incluido en el CPNM y
observamos que niveles de expresión de EZH2 ≥70% se relacionaron con mayor riesgo de
muerte y peor SG. La expresión de EZH2 podría reflejar mayor agresividad en
subpoblaciones celulares desprendidas del tumor primario, considerándose un marcador
de mal pronóstico.
Conclusiones
La integración del perfil molecular tumoral junto con la caracterización de CTCs brinda una
visión más integral y dinámica de la heterogeneidad tumoral. Esta información combinada
y complementaria posibilita una estratificación del riesgo de recidiva y/o desarrollo de
metástasis, ayudando a la toma de decisiones terapéuticas. Además, permite una
monitorización en tiempo real de la enfermedad, siendo clave para una medicina moderna
más personalizada.},
abstract = {Introduction
Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide(1). Non-small cell lung
cancer (NSCLC) is the most common histological subtype, comprising 80% of all cases, and
the only one eligible for surgical treatment in resectable stages (I-III)(2). Despite surgical
resection, relapse rates are unacceptably high, ranging from 30–35% and early in the first
5 years, mainly due to minimal residual disease(3).
with a 5‐year rate overall survival of 15-20%(3). The complex tumor heterogeneity in the
same patient and between patients, combined with an uncertain prognostic variability of
this disease, raises the question of which factors and biomarkers are responsible for these
differences.
Circulating tumor cells (CTCs) are analytes derived from the primary tumor and can be
detected in peripheral blood. They are related to the metastatic process as a potential
prognostic factor(4)(5). CTCs are highly heterogeneous and different subpopulations may
exist in the same patient(6). Phenotypic and molecular characterization of CTCs provides
additional information about tumor biology. Next-generation sequencing (NGS) facilitates
personalized genetic panels for a more exhaustive molecular analysis of tumor type. The
analysis of multiple genes and alterations can be done in a single sample(7).
The main objective of this thesis is to analyze the prognostic value of liquid biopsy markers
and the molecular tissue analysis, as well as their potential combined analysis advantages
as sources of tumor biological information in patients with early stages of NSCLC treated
with radical surgery. The specific objectives are the following: 1) Phenotypic
characterization of CTCs, specifically the EZH2 protein (a member of the Polycomb
repression complex 2), 2) Molecular tumor analysis using a personalized mutational profile
of 50 genes involved in different biological processes, and 3) Analysis between tissue
molecular characterization and CTCs and their prognostic value. In this context, we
hypothesize that the detection of this subtype of EZH2-CTCs in combination with specific
tumor mutations could contribute as prognostic biomarkers and indicators of minimal
residual disease in early-stage NSCLC, guiding possible postoperative treatment strategies.
Materials and Methods
This is a prospective observational cohort of patients with stage I-III NSCLC treated with
radical surgery as the first treatment option between July 2017 and December 2019.
Two blood samples were collected for CTCs isolation and subsequent EZH2
characterization: one prior to surgery (CTC1) and another one month after resection
(CTC2). During surgery, a tumor sample was extracted for targeted NGS sequencing using a
customized 50-gene panel, from a subset of patients. The MACs® methodology was used for
CTC isolation and the rabbit anti-EZH2 antibody was used for phenotypic characterization.
Tumor DNA was extracted using the NucleoSpin® Tissue kit and sequencing was performed
using NGS using a customized 50-gene panel. Results
A total of 76 patients were included for liquid biopsy analysis and a subgroup of 23 patients
for tissue analysis, with a 5-year follow-up. As results, 66% of the series were men, with a
mean age of 67 years old and 81% were smokers. The most common histological subtype
was adenocarcinoma (65.8%), and lobectomy was the main type of lung resection
performed (77.6%).
The number of CTCs detected significantly decreased between CTC1 and CTC2 (p < 0.0001)
after surgery. CTCs+ patients with high EZH2 expression (≥70%) had a higher risk of death
(p = 0.018). The most frequently mutated genes were TP53, FLT1, MUC5AC, EGFR, and
NLRP3. Molecular analysis revealed five gene pairs with co-occurring mutations of
statistical significance: CD163–TLR4 (p = 0.0056), FGF10–FOXP2 (p = 0.0118), ADAMTSL3–
FLT1 (p = 0.0142), ADAMTSL3–MUC5AC (p = 0.0144), and MUC5AC–NLRP3 (p = 0.0183), as
well as a single mutually exclusive genetic interaction: RIN3 and TP53 (p = 0.0457).
Grouping pathogenic clinical variants with those of uncertain significance (VUS) revealed a
higher mutational burden in patients who experienced recurrence (p = 0.0404).
Discussion
Next-generation sequencing (NGS) enables comprehensive molecular analysis of tumors
through customized gene panels. Precision medicine uses NGS to identify tumor
heterogeneity, predict disease progression, and guide treatment options based on the
potential risk of recurrence. In our study, we selected a personalized panel of 50 genes
involved in distinct biological processes (embryological development, COPD-related
processes, inflammation, and tumor proliferation), analyzing their interaction, both cooccurring
and mutually exclusive events, and their relationship with prognosis. In our
molecular analysis, the most frequently mutated gene was TP53, observed mainly in locally
advanced disease stages (stage III). Regarding genetic interactions, five co-occurring
mutations with statistical significance were observed: CD163-TLR4, FGF10-FOXP2,
ADAMTSL3-FLT1, ADAMTSL3-MUC5AC, and MUC5AC-NLRP3, as well as one exclusive
mutation: RIN3-TP53. These interactions suggest possible convergent pathways involved in
tumor development and pathways of tumor transformation, respectively.
Liquid biopsy is a valuable tool for detecting tumor-derived biomarkers such as circulating
tumor cells (CTCs), providing more precise real-time information about the tumor. Its
detection and its dynamics analysis allow disease monitoring. In our study, we observed a
significant decrease in the number of CTCs because of the surgery. The absence of
postoperative CTCs could be positively associated with prognosis, while persistence would
imply disease persistence (minimal residual disease) despite surgery. Furthermore, the
phenotypic and molecular characterization of these cells provides more precise information
about the different subpopulations. In our study, we selected the protein EZH2 due to its
prognostic implications in certain types of cancer, including NSCLC, and we observed that
EZH2 expression levels ≥70% were associated with a higher risk of death and worse OS.
EZH2 expression could reflect greater aggressiveness in cell subpopulations detached from
the primary tumor and is considered a marker of poor prognosis. Conclusions
Integrating the molecular profile of tumors and CTCs characterization provides a more
comprehensive and dynamic view of tumor heterogeneity. This combined approach enables
risk stratification of recurrence and/or metastasis development, aiding therapeutic
decision-making. It also enables real-time disease monitoring, which is key to more
personalized modern medicine.},
organization = {Tesis Univ. Granada.},
organization = {Consejería de Salud de la Junta de Andalucía},
organization = {GlaxoSmithKline España (GSK España) (número de subvención: PIP-0192- 2020)},
publisher = {Universidad de Granada},
title = {Valor clínico de la caracterización de células tumorales circulantes y análisis molecular de tejido en estadios iniciales de cáncer de pulmón no microcítico},
author = {Moyano Rodríguez, María José},
}