New methodologies based on nanotechnology to prepare libraries for massive sequencing: T cell receptor (TCR) and small RNA

Abstract

Desde el descubrimiento del ADN, los investigadores han centrado todos sus esfuerzos en crear metodologías y técnicas que nos permitieran leer la información que contenían los genes. En un primer lugar, la secuenciación Sanger revolucionó la investigación, siendo una de las primeras tecnologías que nos permitían saber la secuencia de una región del ADN. Décadas más tarde, el desarrollo de la secuenciación masiva permitiría obtener millones de secuencias simultáneamente, generando así gran cantidad de datos. A pesar del avance que supone la secuenciación masiva, ésta aún presenta limitaciones y fuentes de error que hacen que, en muchos casos, los datos no sean reproducibles o fiables. Las principales fuentes de error se encuentran durante el proceso de preparación de librerías o la secuenciación. Hay diversos pasos en ambos procediminetos que pueden sesgar los resultados o inducir errores, por ejemplo, la ligación de los adaptadores necesarios para la secuenciación masiva o la amplificación por PCR del material genético. Por otro lado, la secuenciación masiva está limitada a lecturas cortas, de hasta unos 600 nucleótidos. Sin embargo, el desarrollo de tecnologías capaces de obtener lecturas de decenas de miles de nucleótidos con alta precisión (secuenciación de tercera generación) es muy prometedor. Durante esta estudio se han desarrollado dos metodologías que intentan mitigar los problemas asociados a la preparación de librerías abordando secuencias largas y cortas. Para las secuencias largas desarrollamos la metodología de preparación de librerías la cadena β del receptor de linfocitos T (TCR, del inglés T cell receptor) y para las cortas, la del ARN de pequeño tamaño. En ambos casos hacemos uso de micropartículas magnéticas que nos permiten unir de manera covalente las moléculas de ADN de interés e incluirles secuencias como los adaptadores de secuenciación masiva sin necesidad de ligación. Asimismo, nos facilitan el cambio de reactivos y la eliminación de desechos de reacciones anteriores gracias a su magnetismo. La metodología para el TCRβ nos ha permitido llevar a cabo un estudio piloto para conocer el papel de la inmunidad adaptativa en el tejido adiposo (AT, del inglés adipose tissue). Inicialmente, se pensaba que el AT era un mero almacén de lípidos, sin embargo, el concepto ha cambiado a lo largo de los años. Actualmente, se reconoce el AT como un órgano endocrino, así como su papel en la termogénesis adaptativa (sin temblores). En los últimos años se ha demostrado que el AT tiene un rol importante en el sistema inmunitario, tanto en el innato como en el adaptativo. El AT contiene gran cantidad de células inmunitarias, así como estructuras linfoides que se consideran órganos linfoides secundarios o terciarios, conocidas como FALCs (del inglés, fat-associated lymphoid clusters). Cada tipo celular tiene un papel importante en alguna de las funciones del AT y, además, contribuyen directa o indirectamente a otras. El gran número de células T de memoria residentes en tejido (Trm, del inglés tissue-resident memory T cells) postulan al AT como un pilar fundamental en la defensa contra virus, bacterias y otros patógenos. Sin embargo, se han llevado a cabo pocos estudios en humanos. En este estudio, recogimos muestras humanas de sangre, hígado y tejido adiposo, tanto omental como subcutáneo, de pacientes obesos que se sometieron a una cirugía bariátrica. El objetivo fue arrojar luz sobre la relación entre estos tejidos con la inmunidad adaptativa y compararlos con la sangre, mediante técnicas de secuenciación masiva, ensayos funcionales y citometría de flujo. Los principales hallazgos indicaron que los tejidos tenían un repertorio de linfocitos T menos diverso que la sangre, y estaban caracterizados por una clonalidad hiperexpandida. Además, predijimos la presencia de TCRs específicos para epítopos virales como el citomegalovirus, que confirmamos mediante ensayos funcionales. Estos ensayos reportaron un número significativamente mayor de linfocitos T reactivos a citomegalovirus en el AT omental. Por último, observamos que la mayoría de los linfocitos en el AT tenían un fenotipo Trm. Por otro lado, este estudio nos permitió observar TCRβs no canónicos. La formación del TCR se lleva a cabo por la recombinación somática de sus segmentos génicos V, D y J. Esta recombinación es imprecisa, eliminando y añadiendo nucleótidos en la unión de los segmentos. De esta manera se crea la región hipervariable CDR3 (del inglés, complementary-determining región 3), fundamental para el reconocimiento de antígenos. Gracias a la secuenciación masiva del TCRβ completo, observamos reordenamientos aberrantes donde se producía una fusión entre dos segmentos V tanto en sangre como en AT. Aunque en baja frecuencia, esto indica una selección previa de linfocitos con TCRs no canónicos que permanecen en la memoria inmunológica. Se llevaron a cabo experimentos para demostrar su veracidad y comprobar que no fueran artefactos creados ni en la preparación de librerías ni en la secuenciación. Del mismo modo, realizamos ensayos in vitro con células T knock-out para el TCRβ introduciendo diversas construcciones de TCRs y verificando su ensamblaje en la membrana celular. En la búsqueda de innovación tecnológica en la secuenciación masiva, se desarrollaron metodologías basadas en nanotecnología para la preparación de librerías. Sin embargo, debido al tiempo limitado del estudio, no fue posible realizar comparaciones directas con kits comerciales. Del mismo modo, la validación de la metodología para ARN pequeño con muestras reales está aún pendiente. A pesar de estas limitaciones, la investigación supone un gran avance en la comprensión de la inmunidad adaptativa, especialmente en el tejido adiposo, así como en la generación de diversidad del TCRβ, y sienta las bases para futuros progresos en tecnologías de secuenciación

Since the discovery of DNA, researchers have devoted all their efforts to creating methodologies and techniques that would allow us to read the information contained in genes. Initially, Sanger sequencing revolutionised the field, being one of the first technologies that enabled us to determine the sequence of a DNA region. Decades later, the development of massive sequencing would allow the simultaneous generation of millions of sequences, thereby producing a large amount of genetic data. Despite the progress presented by massive sequencing, it still exhibits limitations and sources of error that often make data non-reproducible and/or unreliable. The main sources of error occur during the library preparation or sequencing processes. Various steps in both procedures can introduce biases or errors, such as the ligation of adapters necessary for massive sequencing or the PCR amplification of genetic material. Furthermore, massive sequencing is limited to short reads, up to about 600 nucleotides. However, the development of technologies capable of obtaining reads of tens of thousands of nucleotides with high accuracy (third-generation sequencing) is very promising. In this thesis, two methodologies have been developed to address the issues associated with library preparation for both long and short sequences. For long sequences, we developed the library preparation methodology for the β chain of the T cell receptor (TCR). For short sequences, the methodology was created for small RNA. In both cases, the use of magnetic microparticles allows us to covalently couple the DNA molecules of interest and include sequences like massive sequencing adapters without the need for any ligation reaction. Additionally, they facilitate the exchange of reagents and the removal of waste from previous reactions due to their magnetism. The methodology for TCRβ has allowed us to conduct a pilot study to understand the role of adaptive immunity in adipose tissue (AT). AT was initially considered as a mere lipid storage, but its concept has changed over the years. Currently, AT is recognised as an endocrine organ, as well as playing an important role in non-shivering thermogenesis. In recent years, it has been demonstrated that AT plays a significant role in the immune system, both in the innate and adaptive aspects. AT contains a large number of immune cells, as well as lymphoid structures considered secondary or tertiary lymphoid organs, known as FALCs (fat-associated lymphoid clusters). Each cell type has a crucial role in one of AT's functions and contributes directly or indirectly to other functions. The large number of tissue-resident memory T cells (Trm) in adipose tissue suggests its fundamental role in defence against viruses, bacteria, and other pathogens. However, few studies have been conducted in humans. In this study, we collected human samples from blood, liver, and white adipose tissue, both omental and subcutaneous, from obese patients who underwent bariatric surgery. The goal was to shed light on the relationship between these solid tissues and adaptive immunity and compare them with blood using massive sequencing techniques, functional assays, and flow cytometry. The main findings indicated that solid tissues had a less diverse T cell repertoire and were characterised by hyperexpanded clonality. Additionally, we predicted the presence of TCRs specific for viral epitopes such as cytomegalovirus, which we confirmed through functional assays. These assays reported a significantly higher number of cytomegalovirus-reactive T cells in omental AT. Finally, we observed that the majority of T cells in AT had a Trm phenotype. Furthermore, this study allowed us to observe non-canonical TCRβs. TCR formation occurs through somatic recombination of its TRVB, TRDB, and TRJB gene segments. This recombination is imprecise, removing and adding nucleotides at the segment junctions, creating a hypervariable region crucial for antigen recognition. Through complete TCRβ massive sequencing, we observed aberrant rearrangements where the TRVB region consist of a fusion between two TRVB segments in both blood and AT. Although in low frequency, this indicates a previous selection of lymphocytes with non-canonical TCRs that remain in the immunological memory. Experiments were conducted to demonstrate their veracity and ensure they were not artefacts created in the library preparation or sequencing processes. Likewise, in vitro assays were performed with TCRβ knock-out T cells by introducing various TCR constructs and verifying their assembly on the cell membrane. In the pursuit of technological innovation in massive sequencing, nanotechnology-based methodologies were developed for library preparation. However, due to the limited time of the study, direct comparisons with commercial kits were not possible. Likewise, the validation of the methodology for small RNA with real samples remains pending. Despite these constraints, the research contributes valuable insights to the understanding of adaptive immunity, particularly in adipose tissue, as well as to the generation of TCRβ diversity, and provides a foundation for future developments in sequencing technologies.