@misc{10481/108784,
year = {2025},
url = {https://hdl.handle.net/10481/108784},
abstract = {Desde el descubrimiento del ADN, los investigadores han centrado todos sus
esfuerzos en crear metodologías y técnicas que nos permitieran leer la información que
contenían los genes. En un primer lugar, la secuenciación Sanger revolucionó la
investigación, siendo una de las primeras tecnologías que nos permitían saber la secuencia
de una región del ADN. Décadas más tarde, el desarrollo de la secuenciación masiva
permitiría obtener millones de secuencias simultáneamente, generando así gran cantidad
de datos.
A pesar del avance que supone la secuenciación masiva, ésta aún presenta
limitaciones y fuentes de error que hacen que, en muchos casos, los datos no sean
reproducibles o fiables. Las principales fuentes de error se encuentran durante el proceso
de preparación de librerías o la secuenciación. Hay diversos pasos en ambos
procediminetos que pueden sesgar los resultados o inducir errores, por ejemplo, la
ligación de los adaptadores necesarios para la secuenciación masiva o la amplificación
por PCR del material genético. Por otro lado, la secuenciación masiva está limitada a
lecturas cortas, de hasta unos 600 nucleótidos. Sin embargo, el desarrollo de tecnologías
capaces de obtener lecturas de decenas de miles de nucleótidos con alta precisión
(secuenciación de tercera generación) es muy prometedor.
Durante esta estudio se han desarrollado dos metodologías que intentan mitigar
los problemas asociados a la preparación de librerías abordando secuencias largas y
cortas. Para las secuencias largas desarrollamos la metodología de preparación de
librerías la cadena β del receptor de linfocitos T (TCR, del inglés T cell receptor) y para
las cortas, la del ARN de pequeño tamaño. En ambos casos hacemos uso de
micropartículas magnéticas que nos permiten unir de manera covalente las moléculas de
ADN de interés e incluirles secuencias como los adaptadores de secuenciación masiva sin
necesidad de ligación. Asimismo, nos facilitan el cambio de reactivos y la eliminación de
desechos de reacciones anteriores gracias a su magnetismo.
La metodología para el TCRβ nos ha permitido llevar a cabo un estudio piloto
para conocer el papel de la inmunidad adaptativa en el tejido adiposo (AT, del inglés
adipose tissue). Inicialmente, se pensaba que el AT era un mero almacén de lípidos, sin
embargo, el concepto ha cambiado a lo largo de los años. Actualmente, se reconoce el AT
como un órgano endocrino, así como su papel en la termogénesis adaptativa (sin
temblores). En los últimos años se ha demostrado que el AT tiene un rol importante en el
sistema inmunitario, tanto en el innato como en el adaptativo. El AT contiene gran
cantidad de células inmunitarias, así como estructuras linfoides que se consideran órganos
linfoides secundarios o terciarios, conocidas como FALCs (del inglés, fat-associated
lymphoid clusters). Cada tipo celular tiene un papel importante en alguna de las funciones
del AT y, además, contribuyen directa o indirectamente a otras.
El gran número de células T de memoria residentes en tejido (Trm, del inglés
tissue-resident memory T cells) postulan al AT como un pilar fundamental en la defensa
contra virus, bacterias y otros patógenos. Sin embargo, se han llevado a cabo pocos
estudios en humanos. En este estudio, recogimos muestras humanas de sangre, hígado y
tejido adiposo, tanto omental como subcutáneo, de pacientes obesos que se sometieron a una cirugía bariátrica. El objetivo fue arrojar luz sobre la relación entre estos tejidos con
la inmunidad adaptativa y compararlos con la sangre, mediante técnicas de secuenciación
masiva, ensayos funcionales y citometría de flujo. Los principales hallazgos indicaron
que los tejidos tenían un repertorio de linfocitos T menos diverso que la sangre, y estaban
caracterizados por una clonalidad hiperexpandida. Además, predijimos la presencia de
TCRs específicos para epítopos virales como el citomegalovirus, que confirmamos
mediante ensayos funcionales. Estos ensayos reportaron un número significativamente
mayor de linfocitos T reactivos a citomegalovirus en el AT omental. Por último,
observamos que la mayoría de los linfocitos en el AT tenían un fenotipo Trm.
Por otro lado, este estudio nos permitió observar TCRβs no canónicos. La
formación del TCR se lleva a cabo por la recombinación somática de sus segmentos
génicos V, D y J. Esta recombinación es imprecisa, eliminando y añadiendo nucleótidos
en la unión de los segmentos. De esta manera se crea la región hipervariable CDR3 (del
inglés, complementary-determining región 3), fundamental para el reconocimiento de
antígenos. Gracias a la secuenciación masiva del TCRβ completo, observamos
reordenamientos aberrantes donde se producía una fusión entre dos segmentos V tanto en
sangre como en AT. Aunque en baja frecuencia, esto indica una selección previa de
linfocitos con TCRs no canónicos que permanecen en la memoria inmunológica. Se
llevaron a cabo experimentos para demostrar su veracidad y comprobar que no fueran
artefactos creados ni en la preparación de librerías ni en la secuenciación. Del mismo
modo, realizamos ensayos in vitro con células T knock-out para el TCRβ introduciendo
diversas construcciones de TCRs y verificando su ensamblaje en la membrana celular.
En la búsqueda de innovación tecnológica en la secuenciación masiva, se
desarrollaron metodologías basadas en nanotecnología para la preparación de librerías.
Sin embargo, debido al tiempo limitado del estudio, no fue posible realizar comparaciones
directas con kits comerciales. Del mismo modo, la validación de la metodología para
ARN pequeño con muestras reales está aún pendiente. A pesar de estas limitaciones, la
investigación supone un gran avance en la comprensión de la inmunidad adaptativa,
especialmente en el tejido adiposo, así como en la generación de diversidad del TCRβ, y
sienta las bases para futuros progresos en tecnologías de secuenciación},
abstract = {Since the discovery of DNA, researchers have devoted all their efforts to creating
methodologies and techniques that would allow us to read the information contained in
genes. Initially, Sanger sequencing revolutionised the field, being one of the first
technologies that enabled us to determine the sequence of a DNA region. Decades later,
the development of massive sequencing would allow the simultaneous generation of
millions of sequences, thereby producing a large amount of genetic data.
Despite the progress presented by massive sequencing, it still exhibits limitations
and sources of error that often make data non-reproducible and/or unreliable. The main
sources of error occur during the library preparation or sequencing processes. Various
steps in both procedures can introduce biases or errors, such as the ligation of adapters
necessary for massive sequencing or the PCR amplification of genetic material.
Furthermore, massive sequencing is limited to short reads, up to about 600 nucleotides.
However, the development of technologies capable of obtaining reads of tens of
thousands of nucleotides with high accuracy (third-generation sequencing) is very
promising.
In this thesis, two methodologies have been developed to address the issues
associated with library preparation for both long and short sequences. For long sequences,
we developed the library preparation methodology for the β chain of the T cell receptor
(TCR). For short sequences, the methodology was created for small RNA. In both cases,
the use of magnetic microparticles allows us to covalently couple the DNA molecules of
interest and include sequences like massive sequencing adapters without the need for any
ligation reaction. Additionally, they facilitate the exchange of reagents and the removal
of waste from previous reactions due to their magnetism.
The methodology for TCRβ has allowed us to conduct a pilot study to understand
the role of adaptive immunity in adipose tissue (AT). AT was initially considered as a
mere lipid storage, but its concept has changed over the years. Currently, AT is recognised
as an endocrine organ, as well as playing an important role in non-shivering
thermogenesis. In recent years, it has been demonstrated that AT plays a significant role
in the immune system, both in the innate and adaptive aspects. AT contains a large number
of immune cells, as well as lymphoid structures considered secondary or tertiary
lymphoid organs, known as FALCs (fat-associated lymphoid clusters). Each cell type has
a crucial role in one of AT's functions and contributes directly or indirectly to other
functions.
The large number of tissue-resident memory T cells (Trm) in adipose tissue
suggests its fundamental role in defence against viruses, bacteria, and other pathogens.
However, few studies have been conducted in humans. In this study, we collected human
samples from blood, liver, and white adipose tissue, both omental and subcutaneous, from
obese patients who underwent bariatric surgery. The goal was to shed light on the
relationship between these solid tissues and adaptive immunity and compare them with
blood using massive sequencing techniques, functional assays, and flow cytometry. The
main findings indicated that solid tissues had a less diverse T cell repertoire and were
characterised by hyperexpanded clonality. Additionally, we predicted the presence of TCRs specific for viral epitopes such as cytomegalovirus, which we confirmed through
functional assays. These assays reported a significantly higher number of
cytomegalovirus-reactive T cells in omental AT. Finally, we observed that the majority of
T cells in AT had a Trm phenotype.
Furthermore, this study allowed us to observe non-canonical TCRβs. TCR
formation occurs through somatic recombination of its TRVB, TRDB, and TRJB gene
segments. This recombination is imprecise, removing and adding nucleotides at the
segment junctions, creating a hypervariable region crucial for antigen recognition.
Through complete TCRβ massive sequencing, we observed aberrant rearrangements
where the TRVB region consist of a fusion between two TRVB segments in both blood
and AT. Although in low frequency, this indicates a previous selection of lymphocytes
with non-canonical TCRs that remain in the immunological memory. Experiments were
conducted to demonstrate their veracity and ensure they were not artefacts created in the
library preparation or sequencing processes. Likewise, in vitro assays were performed
with TCRβ knock-out T cells by introducing various TCR constructs and verifying their
assembly on the cell membrane.
In the pursuit of technological innovation in massive sequencing,
nanotechnology-based methodologies were developed for library preparation. However,
due to the limited time of the study, direct comparisons with commercial kits were not
possible. Likewise, the validation of the methodology for small RNA with real samples
remains pending. Despite these constraints, the research contributes valuable insights to
the understanding of adaptive immunity, particularly in adipose tissue, as well as to the
generation of TCRβ diversity, and provides a foundation for future developments in
sequencing technologies.},
organization = {Tesis Univ. Granada.},
organization = {Projects PI15/01361 and DTS22/00151 from the Carlos III Health Institute-FEDER},
organization = {Project PIP-0236-2021 from the Ministry of Health and Families of the Andalusian Regional Government},
publisher = {Universidad de Granada},
title = {New methodologies based on nanotechnology to prepare libraries for massive sequencing: T cell receptor (TCR) and small RNA},
author = {Redruello Romero, Anais},
}