Engineering Pseudomonas putida for sustainable production of styrene

Abstract

The depletion of fossil fuels and increased environmental awareness have driven interest in sustainable alternatives for producing valuable chemicals, such as styrene, via microbial biosynthesis. Styrene is a key monomer in the production of polystyrene, its copolymers, and synthetic rubber, with applications in packaging, disposable products, electronics, and tires, amongst others. Conventional styrene production relies on non-renewable petrochemical processes that contribute to environmental pollution and carbon emissions. Consequently, microbial styrene biosynthesis has emerged as a promising sustainable alternative. While styrene can be naturally synthesized by certain plants, the yields are extremely low, making the process economically unfeasible. To improve yields, a biosynthesis pathway has been developed using L-phenylalanine (L-Phe) derived from glucose through two enzymatic reactions. The pathway starts with the deamination of L-Phe into trans-cinnamic acid (tCA) via phenylalanine ammonia-lyase (PAL) enzymes, followed by decarboxylation of tCA to styrene, a step catalysed by ferulic acid decarboxylases (FDC). Although styrene production from glucose has been achieved in organisms such as Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, yields remain limited due to the toxicity of styrene and tCA. These aromatic compounds disrupt cell membranes, compromising their structure and proton gradients, leading to energy depletion and cell death. Addressing this bottleneck requires using more tolerant microorganisms, such as certain Pseudomonas species. Among these, Pseudomonas putida DOT-T1E, a solvent-tolerant strain isolated from a wastewater treatment plant in Granada, is particularly promising. This strain can thrive in the presence of highly toxic compounds such as toluene, propylbenzene, m-xylene, and ethylbenzene, amongst others. Its solvent tolerance is multifactorial, involving adjustments in membrane lipid fluidity, activation of general stress-response systems, increased energy generation, and the induction of specific efflux pumps that extrude solvents. ue to the remarkable ability of P. putida DOT-T1E to tolerate a wide range of aromatic compounds, it was thought that this strain would be an excellent platform for synthesizing aromatic chemicals from sugars. In this way, this thesis explores the engineering of P. putida DOT-T1E as a chassis for sustainable styrene biosynthesis. First, we investigated the physiological and genetic responses of P. putida DOTT1E to tCA and styrene, the intermediate and final product of the biosynthetic pathway. Upon exposure to these compounds, the strain strengthens membrane impermeability through a cis-trans isomerase that converts cis unsaturated fatty acids to their corresponding trans isomers. It also activates stress responses, including chaperone production and the upregulation of reactive oxygen species (ROS)-detoxifying enzymes such as peroxidases and superoxide dismutases. Metabolic adaptations were also observed, with increased activity in the glucose phosphorylative pathway, Entner- Doudoroff enzymes, Krebs cycle enzymes, and the Nuo complex. Furthermore, the strain employs efflux pumps to expel toxic chemicals, with TtgGHI, regulated by TtgV, identified as the most critical pump. Building on this understanding, we focused on the biosynthetic pathway of styrene using P. putida DOT-T1E as a chassis. This involves the conversion of L-Phe to tCA via PAL and the subsequent decarboxylation of tCA to styrene. Since effective decarboxylases for this transformation are typically of fungal origin, we developed a consensus trans-cinnamic acid decarboxylase (PSC1) based on homologous yeast FDC sequences, using the “wholesale” approach. The Pseudomonas-optimized psc1 gene demonstrated effective decarboxylation of tCA to styrene and the optimal pH and temperature conditions for the PSC1 enzyme were established. Then, for styrene production we used P. putida CM12-5, a derivative of DOT-T1E that overproduces L-Phe. Co-expression of pal and psc1 genes in this strain enabled efficient conversion of L-Phe to styrene, achieving a maximum styrene production of over 220 mg L-1. The characterization of PSC1 enzyme revealed that it is a globular dimer with a molecular mass of 104.7 kDa, high thermal stability (Tm 63°C) and it is stable across a range of conditions, operating effectively at 50°C. The crystal structure of PSC1, resolved at 2.1 Å, reveals a homodimer with each monomer comprising three distinct domains. Domain 2 contains a hydrophobic pocket critical for binding both the cofactor (prFMN) and substrate. Mutagenesis experiments identified Arg175, Glu280, and Glu285 as essential for catalytic activity, as substituting these residues with alanine completely inhibited the decarboxylation process. In summary, this thesis highlights the potential of P. putida as a biofactory for sustainable toxic aromatic compound production, providing an eco-friendly alternative to traditional petrochemical processes. Through enzyme engineering, genetic modification and metabolic optimization, this work is a viable approach for bio-based styrene production that aligns with the goals of reducing carbon emissions, decreasing dependence on fossil resources and advancing bio-based chemical production to contribute meaningfully to a circular bioeconomy.

El agotamiento de los combustibles fósiles y el creciente interés por la sostenibilidad ambiental han impulsado la búsqueda de alternativas para la producción de compuestos químicos de valor añadido, como el estireno, a través de procesos de biosíntesis microbiana. El estireno es un monómero esencial en la fabricación de poliestireno, sus copolímeros y caucho sintético, con aplicaciones en sectores como embalaje, productos desechables, electrónica y neumáticos. La producción tradicional de estireno depende de procesos petroquímicos no renovables que generan importantes emisiones de carbono y contribuyen a la contaminación ambiental. En este contexto, la biosíntesis microbiana de estireno ha emergido como una alternativa sostenible y prometedora. Aunque algunas plantas pueden sintetizar estireno de manera natural, los rendimientos son extremadamente bajos, lo que hace que este proceso sea económicamente inviable. Para superar esta limitación, se ha desarrollado una ruta biosintética que utiliza L-fenilalanina (L-Phe, L-phenylalanine), derivada de la glucosa, mediante dos reacciones enzimáticas sucesivas. La primera reacción consiste en la desaminación de L-Phe a ácido trans-cinámico (tCA, trans-cinnamic acid) por acción de la fenilalanina amonio-liasa (PAL, phenylalanine ammonia-lyase). En una segunda reacción, el tCA se descarboxila a estireno mediante la acción de la ferulato descarboxilasa (FDC, ferulic acid decarboxylase). Aunque se ha logrado producir estireno a partir de glucosa en organismos como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, los rendimientos siguen siendo limitados debido a la toxicidad tanto del estireno como del tCA. Estos compuestos aromáticos afectan las membranas celulares, alterando su estructura y afectando al gradiente de protones en las cadenas respiratorias, lo que resulta en la pérdida de la capacidad de generar energía y, finalmente, en la muerte celular. Para abordar este desafío, se hace necesario recurrir a microorganismos tolerantes a estos compuestos tóxicos, como ciertas cepas de la especie Pseudomonas putida. En particular, Pseudomonas putida DOT-T1E, una cepa altamente resistente a disolventes tóxicos y aislada por nuestro grupo de investigación de una planta de tratamiento de aguas residuales en Granada, ha demostrado un notable potencial para estos procesos. DOT-T1E es capaz de sobrevivir en presencia de compuestos altamente tóxicos como tolueno, propilbenceno, m-xileno y etilbenceno. Su tolerancia a los disolventes es multifactorial e involucra varios mecanismos, como ajustes en la fluidez de los lípidos de la membrana, activación de sistemas de respuesta general a estrés y la inducción de un conjunto de bombas de extrusión que exportan los disolventes orgánicos desde el citoplasma, la membrana celular o el periplasma al medio externo. Debido a su gran capacidad para tolerar una amplia gama de compuestos aromáticos, se consideró que P. putida DOT-T1E era una plataforma potencial para la biosíntesis de compuestos aromáticos a partir de azúcares. Esta tesis explora la ingeniería de P. putida DOT-T1E como un chasis para la biosíntesis sostenible de estireno. En primer lugar, investigamos las respuestas fisiológicas y genéticas de P. putida DOT-T1E frente a la exposición a tCA y estireno, intermediario y producto final de la ruta biosintética propuesta. En respuesta a estos compuestos, la cepa refuerza la impermeabilidad de su membrana mediante la isomerización cis-trans de ácidos grasos insaturados, además de activar respuestas al estrés que incluyen la producción de chaperonas y la inducción de enzimas frente a especies reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species), como peroxidasas y superóxido dismutasas. También se observaron adaptaciones metabólicas, como un aumento en la actividad de las rutas fosforilativas de la glucosa, la ruta de Entner-Doudoroff, el ciclo de Krebs y el complejo Nuo. Además, la cepa emplea de manera cooperativa bombas tipo RND para la expulsión de los compuestos tóxicos al medio. Entre las distintas bombas RND destaca el papel de TtgGHI, cuya expresión está regulada por TtgV en respuesta a estireno y tCA. Esta ruta requiere la conversión de L-Phe a tCA mediante una fenilalanina amonio-liasa (PAL), seguida de la descarboxilación de tCA a estireno. Dado que los genes pal que codifican enzimas eficientes en la conversión de L-Phe en tCA habían sido descritos previamente, nosotros nos centramos en el diseño de descarboxilasas de ácido trans-cinámico. Debido a que las descarboxilasas eficaces para este segundo paso suelen ser de origen fúngico, se diseñó una descarboxilasa para ácido transcinámico por consenso (denominada PSC1) a partir de secuencias homólogas de FDC de levaduras y otros hongos, utilizando la aproximación wholesale, previamente descrita para el diseño de proteínas consenso de otras familias. El uso de codones del gen psc1 se optimizó para Pseudomonas. PSC1 mostró actividad descarboxilasa frente a tCA y se determinaron las condiciones óptimas de pH y temperatura para la síntesis de estireno a partir de tCA. Posteriormente, para la producción de estireno, se utilizó P. putida CM12-5, un mutante múltiple de DOT-T1E que sobreproduce LPhe. La co-expresión de los genes pal y psc1 en esta cepa permitió la conversión eficiente de glucosa a L-Phe, a tCA y a estireno, alcanzando una producción máxima de estireno del orden de 220 mg L-1 con bajos niveles de los intermediarios en el medio de cultivo. La caracterización de la enzima PSC1 reveló que se trata de un dímero globular con una masa molecular de 104.7 kDa, alta estabilidad térmica (Tm 63°C) y capacidad de operación en un amplio rango de condiciones, siendo eficaz a 50°C. La estructura tridimensional de PSC1 se resolvió a 2.1 Å, y mostró que era un homodímero. Cada monómero está compuesto de tres dominios distintos, con un bolsillo hidrofóbico en el dominio 2, crítico para la unión del cofactor (prFMN) y el sustrato. Mediante mutagénesis, se identificaron los residuos Arg175, Glu280 y Glu285 como esenciales para la actividad catalítica, ya que la sustitución de éstos por alanina inhibió completamente la descarboxilación. En resumen, esta tesis resalta el potencial de P. putida como chasis para la producción sostenible de compuestos aromáticos tóxicos, proporcionando una alternativa ecológica a los procesos petroquímicos tradicionales. A través de la ingeniería de enzimas, la modificación genética y la optimización metabólica, este trabajo representa un enfoque viable para la producción de estireno de origen biológico que se alinea con los objetivos de reducir las emisiones de carbono, disminuir la dependencia de recursos fósiles y avanzar en la producción química de base biológica para contribuir significativamente a una bioeconomía circular.