Engineering Pseudomonas putida for sustainable production of styrene
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Universidad de Granada
Director
Ramos Martín, Juan LuisDepartamento
Universidad de Granada. Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología MolecularFecha
2025Fecha lectura
2025-02-21Referencia bibliográfica
García Franco, Ana Ángeles. Engineering Pseudomonas putida for sustainable production of styrene. Granada: Universidad de Granada, 2025. [https://hdl.handle.net/10481/103229]
Patrocinador
Tesis Univ. Granada.; Proyectos RTI- 2018-094370-B-100 y TED-2021-129632B-I00 y al contrato contrato de Formación de Personal Investigador PRE2019-087808, financiados por La Agencia Estatal de Investigación (AEI), Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN), y FEDER "Una manera de hacer Europa"Resumen
The depletion of fossil fuels and increased environmental awareness have driven interest
in sustainable alternatives for producing valuable chemicals, such as styrene, via
microbial biosynthesis. Styrene is a key monomer in the production of polystyrene,
its copolymers, and synthetic rubber, with applications in packaging, disposable
products, electronics, and tires, amongst others. Conventional styrene production
relies on non-renewable petrochemical processes that contribute to environmental
pollution and carbon emissions. Consequently, microbial styrene biosynthesis has
emerged as a promising sustainable alternative.
While styrene can be naturally synthesized by certain plants, the yields are
extremely low, making the process economically unfeasible. To improve yields,
a biosynthesis pathway has been developed using L-phenylalanine (L-Phe) derived
from glucose through two enzymatic reactions. The pathway starts with the deamination
of L-Phe into trans-cinnamic acid (tCA) via phenylalanine ammonia-lyase (PAL)
enzymes, followed by decarboxylation of tCA to styrene, a step catalysed by ferulic
acid decarboxylases (FDC). Although styrene production from glucose has been
achieved in organisms such as Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, yields
remain limited due to the toxicity of styrene and tCA. These aromatic compounds
disrupt cell membranes, compromising their structure and proton gradients, leading
to energy depletion and cell death.
Addressing this bottleneck requires using more tolerant microorganisms, such
as certain Pseudomonas species. Among these, Pseudomonas putida DOT-T1E, a
solvent-tolerant strain isolated from a wastewater treatment plant in Granada, is particularly
promising. This strain can thrive in the presence of highly toxic compounds
such as toluene, propylbenzene, m-xylene, and ethylbenzene, amongst others. Its
solvent tolerance is multifactorial, involving adjustments in membrane lipid fluidity,
activation of general stress-response systems, increased energy generation, and the
induction of specific efflux pumps that extrude solvents. ue to the remarkable ability of P. putida DOT-T1E to tolerate a wide range of
aromatic compounds, it was thought that this strain would be an excellent platform
for synthesizing aromatic chemicals from sugars. In this way, this thesis explores the
engineering of P. putida DOT-T1E as a chassis for sustainable styrene biosynthesis.
First, we investigated the physiological and genetic responses of P. putida DOTT1E
to tCA and styrene, the intermediate and final product of the biosynthetic
pathway. Upon exposure to these compounds, the strain strengthens membrane
impermeability through a cis-trans isomerase that converts cis unsaturated fatty acids
to their corresponding trans isomers. It also activates stress responses, including chaperone
production and the upregulation of reactive oxygen species (ROS)-detoxifying
enzymes such as peroxidases and superoxide dismutases. Metabolic adaptations were
also observed, with increased activity in the glucose phosphorylative pathway, Entner-
Doudoroff enzymes, Krebs cycle enzymes, and the Nuo complex. Furthermore, the
strain employs efflux pumps to expel toxic chemicals, with TtgGHI, regulated by
TtgV, identified as the most critical pump.
Building on this understanding, we focused on the biosynthetic pathway of styrene
using P. putida DOT-T1E as a chassis. This involves the conversion of L-Phe to
tCA via PAL and the subsequent decarboxylation of tCA to styrene. Since effective
decarboxylases for this transformation are typically of fungal origin, we developed
a consensus trans-cinnamic acid decarboxylase (PSC1) based on homologous yeast
FDC sequences, using the “wholesale” approach. The Pseudomonas-optimized psc1
gene demonstrated effective decarboxylation of tCA to styrene and the optimal pH
and temperature conditions for the PSC1 enzyme were established. Then, for styrene
production we used P. putida CM12-5, a derivative of DOT-T1E that overproduces
L-Phe. Co-expression of pal and psc1 genes in this strain enabled efficient conversion
of L-Phe to styrene, achieving a maximum styrene production of over 220 mg L-1.
The characterization of PSC1 enzyme revealed that it is a globular dimer with
a molecular mass of 104.7 kDa, high thermal stability (Tm 63°C) and it is stable
across a range of conditions, operating effectively at 50°C. The crystal structure of
PSC1, resolved at 2.1 Å, reveals a homodimer with each monomer comprising three
distinct domains. Domain 2 contains a hydrophobic pocket critical for binding both
the cofactor (prFMN) and substrate. Mutagenesis experiments identified Arg175,
Glu280, and Glu285 as essential for catalytic activity, as substituting these residues
with alanine completely inhibited the decarboxylation process. In summary, this thesis highlights the potential of P. putida as a biofactory for
sustainable toxic aromatic compound production, providing an eco-friendly alternative
to traditional petrochemical processes. Through enzyme engineering, genetic
modification and metabolic optimization, this work is a viable approach for bio-based
styrene production that aligns with the goals of reducing carbon emissions, decreasing
dependence on fossil resources and advancing bio-based chemical production to
contribute meaningfully to a circular bioeconomy. El agotamiento de los combustibles fósiles y el creciente interés por la sostenibilidad
ambiental han impulsado la búsqueda de alternativas para la producción
de compuestos químicos de valor añadido, como el estireno, a través de procesos
de biosíntesis microbiana. El estireno es un monómero esencial en la fabricación
de poliestireno, sus copolímeros y caucho sintético, con aplicaciones en sectores
como embalaje, productos desechables, electrónica y neumáticos. La producción
tradicional de estireno depende de procesos petroquímicos no renovables que generan
importantes emisiones de carbono y contribuyen a la contaminación ambiental. En
este contexto, la biosíntesis microbiana de estireno ha emergido como una alternativa
sostenible y prometedora.
Aunque algunas plantas pueden sintetizar estireno de manera natural, los
rendimientos son extremadamente bajos, lo que hace que este proceso sea económicamente
inviable. Para superar esta limitación, se ha desarrollado una ruta biosintética
que utiliza L-fenilalanina (L-Phe, L-phenylalanine), derivada de la glucosa, mediante
dos reacciones enzimáticas sucesivas. La primera reacción consiste en la desaminación
de L-Phe a ácido trans-cinámico (tCA, trans-cinnamic acid) por acción de
la fenilalanina amonio-liasa (PAL, phenylalanine ammonia-lyase). En una segunda
reacción, el tCA se descarboxila a estireno mediante la acción de la ferulato descarboxilasa
(FDC, ferulic acid decarboxylase). Aunque se ha logrado producir estireno
a partir de glucosa en organismos como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae,
los rendimientos siguen siendo limitados debido a la toxicidad tanto del estireno como
del tCA. Estos compuestos aromáticos afectan las membranas celulares, alterando su
estructura y afectando al gradiente de protones en las cadenas respiratorias, lo que
resulta en la pérdida de la capacidad de generar energía y, finalmente, en la muerte
celular.
Para abordar este desafío, se hace necesario recurrir a microorganismos tolerantes
a estos compuestos tóxicos, como ciertas cepas de la especie Pseudomonas putida. En particular, Pseudomonas putida DOT-T1E, una cepa altamente resistente a disolventes
tóxicos y aislada por nuestro grupo de investigación de una planta de tratamiento de
aguas residuales en Granada, ha demostrado un notable potencial para estos procesos.
DOT-T1E es capaz de sobrevivir en presencia de compuestos altamente tóxicos como
tolueno, propilbenceno, m-xileno y etilbenceno. Su tolerancia a los disolventes es
multifactorial e involucra varios mecanismos, como ajustes en la fluidez de los lípidos
de la membrana, activación de sistemas de respuesta general a estrés y la inducción
de un conjunto de bombas de extrusión que exportan los disolventes orgánicos desde
el citoplasma, la membrana celular o el periplasma al medio externo.
Debido a su gran capacidad para tolerar una amplia gama de compuestos aromáticos,
se consideró que P. putida DOT-T1E era una plataforma potencial para la
biosíntesis de compuestos aromáticos a partir de azúcares. Esta tesis explora la
ingeniería de P. putida DOT-T1E como un chasis para la biosíntesis sostenible de
estireno. En primer lugar, investigamos las respuestas fisiológicas y genéticas de P.
putida DOT-T1E frente a la exposición a tCA y estireno, intermediario y producto
final de la ruta biosintética propuesta. En respuesta a estos compuestos, la cepa
refuerza la impermeabilidad de su membrana mediante la isomerización cis-trans
de ácidos grasos insaturados, además de activar respuestas al estrés que incluyen la
producción de chaperonas y la inducción de enzimas frente a especies reactivas de
oxígeno (ROS, reactive oxygen species), como peroxidasas y superóxido dismutasas.
También se observaron adaptaciones metabólicas, como un aumento en la actividad de
las rutas fosforilativas de la glucosa, la ruta de Entner-Doudoroff, el ciclo de Krebs y
el complejo Nuo. Además, la cepa emplea de manera cooperativa bombas tipo RND
para la expulsión de los compuestos tóxicos al medio. Entre las distintas bombas
RND destaca el papel de TtgGHI, cuya expresión está regulada por TtgV en respuesta
a estireno y tCA.
Esta ruta requiere la conversión de L-Phe a tCA mediante una fenilalanina
amonio-liasa (PAL), seguida de la descarboxilación de tCA a estireno. Dado que los
genes pal que codifican enzimas eficientes en la conversión de L-Phe en tCA habían
sido descritos previamente, nosotros nos centramos en el diseño de descarboxilasas
de ácido trans-cinámico. Debido a que las descarboxilasas eficaces para este segundo
paso suelen ser de origen fúngico, se diseñó una descarboxilasa para ácido transcinámico
por consenso (denominada PSC1) a partir de secuencias homólogas de
FDC de levaduras y otros hongos, utilizando la aproximación wholesale, previamente descrita para el diseño de proteínas consenso de otras familias. El uso de codones
del gen psc1 se optimizó para Pseudomonas. PSC1 mostró actividad descarboxilasa
frente a tCA y se determinaron las condiciones óptimas de pH y temperatura para la
síntesis de estireno a partir de tCA. Posteriormente, para la producción de estireno,
se utilizó P. putida CM12-5, un mutante múltiple de DOT-T1E que sobreproduce LPhe.
La co-expresión de los genes pal y psc1 en esta cepa permitió la conversión
eficiente de glucosa a L-Phe, a tCA y a estireno, alcanzando una producción máxima
de estireno del orden de 220 mg L-1 con bajos niveles de los intermediarios en el
medio de cultivo.
La caracterización de la enzima PSC1 reveló que se trata de un dímero globular
con una masa molecular de 104.7 kDa, alta estabilidad térmica (Tm 63°C) y capacidad
de operación en un amplio rango de condiciones, siendo eficaz a 50°C. La estructura
tridimensional de PSC1 se resolvió a 2.1 Å, y mostró que era un homodímero. Cada
monómero está compuesto de tres dominios distintos, con un bolsillo hidrofóbico en
el dominio 2, crítico para la unión del cofactor (prFMN) y el sustrato. Mediante
mutagénesis, se identificaron los residuos Arg175, Glu280 y Glu285 como esenciales
para la actividad catalítica, ya que la sustitución de éstos por alanina inhibió completamente
la descarboxilación.
En resumen, esta tesis resalta el potencial de P. putida como chasis para la producción
sostenible de compuestos aromáticos tóxicos, proporcionando una alternativa
ecológica a los procesos petroquímicos tradicionales. A través de la ingeniería de enzimas,
la modificación genética y la optimización metabólica, este trabajo representa
un enfoque viable para la producción de estireno de origen biológico que se alinea
con los objetivos de reducir las emisiones de carbono, disminuir la dependencia de
recursos fósiles y avanzar en la producción química de base biológica para contribuir
significativamente a una bioeconomía circular.