Improvements of Ligilactobacillus salivarius CECT5713 resistance to freeze-drying and storage modifying the production conditions and studying the mechanisms involved

Abstract

Ligilactobacillus salivarius CECT5713 is a lactic acid bacterium that can be used to promote human health due to its recognized probiotic properties. Its incorporation in food supplements and medicines requires the application of successive operations, ranging from fermentation to stabilization and final storage at room temperature, which causes different stresses which can generate potential cellular damage and thus, loss of viability and functionality, limiting its commercialization. Two different strategies are widely used to help bacteria overcome stress caused, mainly, by stabilization and storage processes: varying culture conditions exposing the cell to moderate stress during fermentation and adding appropriate protective agents before the stabilization step. In this context, this work aimed at improving the resistance of L. salivarius CECT5713 to freeze-drying and 4 weeks of storage at 37 °C applying both strategies and investigating the preservation mechanisms involved. In the first part of this work, the effect of several culture production parameters (temperature, pH, neutralizing solution, culture medium composition), harvesting time, biomass washing, and some protective molecules on the resistance of L. salivarius CECT5713 to each step of the manufacturing process, was evaluated. Apply a fermentation temperature higher, harvest the cells in the stationary phase, and use protective formulations involving maltodextrin and antioxidants molecules (sodium ascorbate or sodium citrate) led to the production of a population more resistant to freeze-drying and 4 weeks of storage at 37 °C. In the second part, a further investigation focused on the protection step was performed. The effect of several protective formulations (maltodextrin, antioxidants molecules, trehalose, fructooligosaccharides) on L. salivarius CECT5713 resistance to the stabilization and storage processes was studied by characterizing the bacterial concentrates at various levels (biological, physical, biochemical) to better understand the protective mechanisms involved. Immobilizing the cells in a glassy matrix during storage, well below the glass transition temperature, was a key factor in maintaining the storage stability of the strain. The strain was resistant to freezing, but it displayed slight and strong sensitivity to freeze-drying and storage steps, respectively. This was associated with the possible occurrence of lipid oxidation reactions and alterations of several cellular components (proteins, nucleic acids, peptidoglycan of cell wall) along the manufacturing process. In the third part, an extensive comparative, at several levels (biological, physical, biophysical, biochemical), of two L. salivarius CECT5713 populations, exhibiting different levels of resistance to the manufacturing process (initial and final conditions of this research work), was performed. The main goal was to identify markers of injury and protection and the most relevant strain characteristics for increasing the knowledge of the mechanisms underlying its preservation. As well as confirming the results obtained in the previous chapter, the high content of ΔC19:0 observed in the resistant conditions was correlated with membrane rigidification and a minor loss of membrane integrity. Finally, this work has been concluded by improving the resistance of L. salivarius CECT5713 to freeze-drying and 4 weeks of storage at 37 °C by modifying both culture and protection conditions, while gaining knowledge of the degradation and preservation mechanisms involved.

Ligilactobacillus salivarius CECT5713 es una bacteria acido láctica que puede utilizarse para promover la salud humana debido a sus reconocidas propiedades probióticas. Su incorporación en complementos alimentarios y medicamentos requiere la aplicación de sucesivas operaciones, que van desde la fermentación al almacenamiento final a temperatura ambiente, pasando por la etapa de estabilización, que provocan diferentes tipos de estrés a las células que pueden generar daño celular y, por tanto, perdidas de viabilidad y funcionalidad, limitando su comercialización. Dos estrategias diferentes, para ayudar a las bacterias a superar el estrés causado principalmente por las etapas de estabilización y almacenamiento, son ampliamente utilizadas. La primera se basa en variar las condiciones de cultivo exponiendo a la célula a estreses moderados durante la fermentación y la segunda en añadir agentes protectores adecuados antes de la etapa de estabilización. En este contexto, este trabajo tuvo como objetivo mejorar la resistencia de L. salivarius CECT5713 a la liofilización y al almacenamiento de 4 semanas de duración a 37 °C aplicando ambas estrategias e investigando los mecanismos de protección implicados. En la primera parte de este trabajo, se evaluó el efecto de varias condiciones de cultivo (temperatura, pH, solución neutralizante, composición del medio de cultivo), del tiempo de cosecha, del lavado de la biomasa y de algunas moléculas protectoras en la resistencia de L. salivarius CECT5713 en cada una de las etapas que componen el proceso de fabricación. La aplicación de una temperatura de fermentación más alta, la cosecha de las células en la fase estacionaria y el uso de fórmulas protectoras con maltodextrina y moléculas antioxidantes (ascorbato de sodio o citrato de sodio) condujeron a la producción de una población más resistente a la liofilización y al almacenamiento de 4 semanas a 37 °C. En la segunda parte, se realizó una investigación más focalizada en la etapa de protección. Se estudió el efecto de varias formulaciones protectoras (maltodextrina, moléculas antioxidantes, trehalosa, fructooligosacáridos) en la resistencia de L. salivarius CECT5713 a los procesos de estabilización y almacenamiento, caracterizando los concentrados bacterianos a varios niveles (biológico, físico, bioquímico) para comprender mejor los mecanismos de protección implicados. La inmovilización de las células en una matriz vítrea durante el almacenamiento, muy por debajo de la temperatura de transición vítrea, fue un factor clave para mantener la estabilidad durante el almacenamiento de la cepa. La cepa mostró ser resistente a la congelación, pero manifestaba una ligera sensibilidad a la liofilización y una fuerte sensibilidad al almacenamiento. Esto se asoció con la posible aparición de reacciones de oxidación en los lípidos y con alteraciones de varios componentes celulares (proteínas, ácidos nucleicos, peptidoglicanos de la pared celular) a lo largo del proceso de fabricación. En la tercera parte, se realizó una extensa comparativa, a varios niveles (biológico, físico, biofísico, bioquímico), de dos poblaciones de L. salivarius CECT5713, que presentaban diferentes niveles de resistencia al proceso de fabricación (condiciones iniciales y finales de este trabajo de investigación). El objetivo principal de esta parte fue identificar marcadores de lesión y protección y las características más relevantes de la cepa para aumentar el conocimiento de los mecanismos implicados en su conservación. Además de confirmar los resultados obtenidos en el capítulo anterior, el alto contenido de ΔC19:0 observado en la población más resistente se correlacionó con la rigidificación de la membrana y con una menor pérdida de su integridad. Por último, este trabajo ha concluido con la mejora de la resistencia de L. salivarius CECT5713 a la liofilización y al almacenamiento de 4 semanas a 37 °C mediante la modificación de las condiciones de cultivo y de protección. Además, se han dado a conocer algunos de los mecanismos de degradación y protección implicados.