Estudio de los efectos de mutaciones naturales y modificaciones postraduccionales sobre la estabilidad y funcionalidad de la enzima asociada a cáncer NQO1

Abstract

La estabilidad y función de las proteínas puede verse afectada por el efecto de mutaciones que provocan la sustitución de un aminoácido por otro (mutación de cambio de sentido) así como por modificaciones postraduccionales. Cuando ese efecto es heredable y se pierde la estabilidad y función de la proteína, a menudo se desarrollan enfermedades conocidas como enfermedades de pérdida de función. Por ejemplo, las flavoproteínas, que tienen múltiples funciones, están asociadas a distintas enfermedades hereditarias debido a mutaciones que provocan la pérdida de su función. Concretamente, en esta tesis vamos a estudiar el efecto de mutaciones naturales y modificaciones postraduccionales en la proteína NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), una flavoproteína multifuncional cuya pérdida de función por el polimorfismo P187S se ha asociado con un posible incremento del riesgo de padecer cáncer. En primer lugar, hemos estudiado distintas variantes naturales que han sido detectadas en estudios de secuenciación masiva en la población y en muestras de cáncer, pero cuyo efecto sobre la estabilidad y función de NQO1 se desconocía. Estas variantes presentaban mutaciones de cambio de sentido en el extremo N-terminal y en el sitio activo de la proteína, y el efecto de esas mutaciones se propagó a regiones alejadas del sitio mutado, provocando en algunos casos una menor estabilidad térmica, una reducción en la afinidad por FAD y una menor actividad catalítica. En segundo lugar, comparamos como se asemeja la desestabilización causada por una fosforilación a la causada por el polimorfismo asociado a enfermedad P187S, utilizando la mutación fosfomimética S82D. Para ello, estudiamos como ambas mutaciones afectaban a la estabilidad estructural de la proteína en distintas regiones mediante intercambio de hidrógeno-deuterio acoplado a espectrometría de masas (HDX-MS) combinándolo con estudios de proteólisis limitada, ensayos enzimáticos y experimentos en cultivos celulares. Los resultados mostraron que tanto S82D como P187S tienen varios efectos sobre NQO1, como la reducción de la actividad catalítica o la estabilidad intracelular, que se produce por la propagación estructural de su efecto desestabilizante a varios sitios funcionales. En tercer y último lugar, comparamos las consecuencias de la fosforilación específica de sitio en tres residuos (S40, S82 y T128) que presentan distinta exposición al solvente 6 siguiendo la metodología utilizada con S82. En este caso, vimos que cada mutación fosfomimética (S40D, S82D y T128D) tuvo un efecto diferente. S82D causó la mayor desestabilización afectando fuertemente a la afinidad por FAD y su actividad enzimática y a la estabilidad conformacional e intracelular. Mientras que S40D afectó principalmente a la estabilidad conformacional e intracelular y T128D no tuvo un efecto apreciable sobre la estabilidad de NQO1, pero sí sobre la actividad enzimática.

The stability and function of proteins can be affected by mutations that result in the substitution of one amino acid for another (missense mutation) as well as by posttranslational modifications. When this effect is hereditary and leads to the loss of protein stability and function, it often results in diseases known as loss-of-function diseases. For example, flavoproteins, which have multiple functions, are associated with various hereditary diseases due to mutations that lead to the loss of their function. Specifically, in this thesis, we are going to study the effect of natural mutations and post-translational modifications in the NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) protein, a multifunctional flavoprotein, whose loss of function due to the P187S polymorphism has been linked to a potential increase in the risk of cancer. First, we have studied various natural variants that have been detected in population and cancer sample massive sequencing studies, but whose effect on the stability and function of NQO1 was unknown. These variants had missense mutations at the Nterminal end and in the active site of the protein, and the effect of these mutations propagated to distant regions from the mutated site, causing, in some cases, decreased thermal stability, reduced affinity for FAD, and reduced catalytic activity. Secondly, we compared how the destabilization caused by phosphorylation resembled that caused by the disease-associated P187S polymorphism, using the phosphomimetic mutation S82D. To do this, we studied how both mutations affected the structural stability of the protein in different regions using hydrogen-deuterium exchange coupled with mass spectrometry (HDX-MS), combined with limited proteolysis studies, enzymatic assays, and cell culture experiments. The results showed that both S82D and P187S had various effects on NQO1, such as reduced catalytic activity or intracellular stability, which occurred due to the structural propagation of their destabilizing effect to various functional sites. Lastly, we compared the consequences of site-specific phosphorylation at three residues (S40, S82, and T128) with varying solvent exposure following the methodology used with S82. In this case, we observed that each phosphomimetic mutation (S40D, S82D, and T128D) had different effects. S82D caused the most destabilization, significantly affecting FAD affinity, enzymatic activity, and conformational and intracellular 8 stability. While S40D mainly affected conformational and intracellular stability, and T128D had no appreciable effect on the stability of NQO1 but did impact enzymatic activity.