Gut microbiome-intestinal barrier crosstalk during Iron deficiency anaemia: use of nutrition-based Strategies

Abstract

La anemia es un síndrome plurietiológico caracterizado por un descenso en los niveles de hemoglobina por debajo de las concentraciones fisiológicas, que pueden variar de acuerdo a la edad, género o condición fisiológica. Se estima que afecta al menos a un tercio de la población mundial, con una prevalencia aumentada en países subdesarrollados, donde supone una carga económica considerable. La deficiencia de hierro es la causa más frecuente de anemia, produciendo aproximadamente el 50% de los casos, y considerándose la deficiencia de micronutrientes más prevalente a nivel mundial. La escasa variedad de alternativas terapéuticas es uno de los mayores problemas de la anemia ferropénica (AF). Los suplementos de hierro orales constituyen la primera línea de tratamiento a pesar de sus numerosos efectos adversos. Dado que la absorción de hierro en el intestino es muy limitada, el hierro de los suplementos que no ha sido absorbido se acumula en el intestino, produciendo estrés oxidativo y deteriorando el epitelio intestinal. El exceso de hierro también produce alteraciones en el microbioma. Por tanto, las alteraciones gastrointestinales son efectos adversos muy comunes de los suplementos de hierro, en muchas ocasiones causando el abandono del tratamiento cuando los síntomas de la anemia desaparecen pero antes de que los depósitos de hierro se recuperen completamente, lo que suele provocar recidivas. Un porcentaje considerable de las anemias ferropénicas acaban volviéndose refractarias al tratamiento y se cronifican. A pesar de que se conoce el efecto perjudicial de los suplementos de hierro para la salud intestinal, las cuestiones relacionadas con la alteración del microbioma y el estado del epitelio intestinal durante la AF todavía permanecen abiertas. El intestino humano alberga la comunidad de microorganismos más amplia de todo el organismo. Durante los últimos años, se han establecido multitud de relaciones causales entre alteraciones del microbioma intestinal y cambios en el estado de salud. Algunos de estos estudios analizan las alteraciones microbiológicas a nivel intestinal durante la AF y sugieren que los microorganismos podrían estar contribuyendo a la génesis de la AF al competir por el hierro con las células del hospedador o alterar la homeostasis intestinal. La mayoría de los estudios se centran en el microbioma del intestino grueso y las heces y no utilizan las nuevas metodologías de secuenciación masiva. El microbioma intestinal es un componente clave de la barrera intestinal, ya que la disbiosis intestinal suele asociarse con alteraciones de dicha barrera. En condiciones fisiológicas, existen una gran variedad de antígenos, toxinas y microorganismos en el lumen intestinal y la función de la barrera es prevenir su paso a la circulación sistémica. Existen evidencias en la bibliografía de que un paso incrementado del contenido del lumen a los tejidos puede desencadenar inflamación y agravar ciertas enfermedades. La barrera intestinal apenas ha sido estudiada en el contexto de la AF, a pesar de que se conoce que la falta de hierro puede dificultar la replicación del ADN y el ciclo celular. Dado que abordar el deterioro del microbioma y de la barrera intestinal sería una de los objetivos a la hora de optimizar las terapias de la AF, la leche fermentada de cabra se ha estudiado como una estreategia nutricional para restaurar la salud intestinal en este contexto. El alto valor nutricional de la leche de cabra junto con su reducido riesgo de alergenicidad la sitúa en un lugar aventajado para su uso en determinadas situaciones patológicas. Los oligosacáridos son los nutrientes de mayor interés desde el punto de vista microbiológico debido a su alto potencial prebiótico. Estos oligosacáridos se encuentran en mayor concentración en la leche de cabra que en la leche de otros animales, además de ser estructuralmente más diversos y guardar una gran similitud con los oligosacáridos de la leche materna humana, que constituye el patrón de referencia en cuanto a efectos beneficiosos intestinales. Por otro lado, la fermentación mejora la digestibilidad de la leche, sus características organolépticas y la biodisponibilidad de los oligosacáridos, aumentando su potential prebiótico. Se ha demostrado que la leche de cabra aumenta la biodisponibilidad de hierro, pero se desconoce si este efecto depende de sus propiedades moduladoras del microbioma intestinal. Se ha descrito que los oligosacáridos de la leche de cabra ejercen efectos beneficiosos sobre el microbioma intestinal y la integridad de la barrera, pero los estudios sobre la leche fermentada de cabra son escasos. En la presente tesis se ha llevado a cabo una caracterización completa de las alteraciones del microbioma intestinal a lo largo del tracto digestivo durante la AF, así como un análisis en profundidad de la integridad de la barrera, para valorar el estado general de la salud intestinal. Además, se ha estudiado la capacidad de la leche fermentada de cabra para recuperar la AF, así como sus propiedades moduladoras sobre la composición del microbioma y la integridad de la barrera intestinal. La AF se indujo experimentalmente en un modelo animal mediante el uso de una dieta carente de hierro (AIN-93G sin hierro) durante un periodo de 40 días. Al final del periodo de inducción, parte de los animales se sacrificaron, obteniéndose las siguientes muestras biológicas: sangre total, suero, contenido y mucosa intestinal de cada segmento del tracto digestivo (duodeno, yeyuno, íleo, ciego y colon) y heces. Los animales restantes se sometieron a un periodo de tratamiento con dieta basada en leche fermentada de cabra o dieta estándar durante 30 días adicionales. Al terminar este periodo, los animales fueron sacrificados y se obtuvieron muestras biológicas similares. Para confirmar que la AF se había inducido correctamente en los animales de experimentación se realizó el estudio de parámetros hematológicos. El microbioma intestinal se analizó en el contenido de todos los segmentos intestinales (duodeno, yeyuno, íleon, ciego y colon) y en las heces. En una primera aproximación, se realizó la secuenciación de la subunidad 16S del ARN ribosómico (secuenciación de amplicones) para identificar la región intestinal con mayor disbiosis. La secuenciación de amplicones demostró que existía una disbiosis intestinal en respuesta a la AF, más intensa hacia el intestino grueso (ciego y colon). Se realizó un análisis predictivo funcional sobre los datos de secuenciación que reveló que las rutas metabólicas microbianas más enriquecidas en el intestino grueso durante la AF estaban relacionadas con el metabolismo de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC). La determinación de estos metabolitos (ácidos butírico, propiónico y acético) confirmó un incremento de su concentración durante la AF, especialmente en el colon. De igual manera, el análisis taxonómico mostró un aumento de los miembros del género Clostridium en el intestino grueso de los animales anémicos, que estaban positivamente correlacionados con los niveles de ácido butírico y propiónico en el colon. El colon fue, por tanto, identificado como la región intestinal con la mayor disbiosis para llevar a cabo un análisis detallado del microbioma intestinal mediante secuenciación de metagenoma completo (secuenciación shotgun). Se confirmó un aumento de especies del género Clostridium, positivamente correlacionadas con los niveles de ácido butírico y propiónico, así como un aumento de vías microbianas productoras de AGCC, nucleótidos y un aumento de la carga bacteriana durante la AF. Así, especies clave del género Clostrdium y metabolitos clave fueron identificados como los principales contribuyentes a la disbiosis producida en respuesta a la AF. Dadas sus funciones beneficiosas en el epitelio intestinal, es muy probable que los AGCC formen parte de mecanismos de compensación desencadenados como consecuencia de la AF para aliviar las alteraciones sistémicas o intestinales derivadas de la enfermedad. El análisis de la barrera intestinal en la mucosa del colon mediante secuenciación de ARN mensajero mostró un epitelio intestinal infradesarrollado debido a la infraexpresión de términos Gene Onthology (GO) relacionados con el desarrollo y la señalización sináptica del sistema nervioso entérico, desarrollo del tracto digestivo, ensamblaje de las uniones celulares e integridad celulares y organización de la matriz extracelular. Dado que el metabolismo del colágeno, como componente mayoritario de la matriz extracelular, es dependiente de hierro, se analizaron específicamente genes y proteínas relacionados con el colágeno, encontrando niveles disminuidos durante la AF. Debido a la estrecha relación existente entre los AGCC y la estabilización de la hipoxia intestinal y al papel de la hipoxia en el mantenimiento de la barrera intestinal, se analizaron específicamente genes diana de hipoxia mediante PCR cuantitativa. La ausencia de diferencias en la expresión entre los grupos experimentales control y anémico sugiere que la alteración observada en la barrera intestinal es independiente de hipoxia. Por último, el aumento en los marcadores de translocación microbiana (lipopolisacárido bacteriano e inmunoglobulinas específicas de bacterias) en los animales anémicos apoya la falta de integridad de la barrera intestinal durante la AF. Durante el periodo de tratamiento con las dietas a ensayar, la determinación de parámetros hematológicos mostró que la AF se recuperó más eficientemente con la dieta basada en leche fermentada de cabra respecto a la estándar. Las propiedades moduladoras del microbioma intestinal de la leche fermentada de cabra se estudiaron en contenidos intestinales de todos los segmentos del tracto digestivo recolectados tras el periodo de tratamiento. La dieta basada en leche fermentada de cabra dio lugar a un microbioma más diverso en cuanto al número de especies en la comunidad microbiana, y funcionalmente más activo que la dieta estándar, tanto en el intestino delgado como en el grueso de animales controles, lo que está en línea con una recuperación más eficiente de la AF. En cuanto a sus propiedades restauradoras del microbioma intestinal, tanto la dieta basada en leche fermentada de cabra como la dieta estándar recuperaron la disbiosis asociada a la AF del intestino delgado. Sin embargo, la dieta basada en leche fermentada de cabra fue más eficiente al recuperar la disbiosis más intensa del colon, confirmando sus propiedades prebióticas. En ningún caso se recuperó completamente el microbioma en los animales anémicos en relación al grupo control en durante el periodo de tratamiento empleado. Por último, la dieta basada en leche fermentada de cabra no mostró ningún efecto positivo adicional sobre la integridad de la barrera intestinal comparada con la dieta estándar. Ambas dietas recuperaron los genes infraexpresados afectados durante la AF, restaurando la función de la barrera intestinal. La ausencia de diferencias significativas entre las concentraciones séricas de lipopolisacárido bacteriano entre el grupo control y el anémico alimentados con dieta basada en leche fermentada de cabra o dieta estándar sugiere un estado similar de integridad de la barrera intestinal tras el tratamiento con ambas dietas. En esta tesis se han analizado las alteraciones del microbioma y la barrera intestinal en un modelo animal representativo de una anemia ferropénica nutricional. Con el descubrimiento de una disbiosis intestinal intensa en el intestino grueso con un aparente papel compensador y un estado detereriorado del epitelio intestinal que genera translocación de componentes bacterianos, adoptar nuevas aproximaciones de tratamiento para la AF enfocados a la restauración de la salud intestinal parece de gran importancia. La leche fermentada de cabra se ha estudiado en este sentido, recuperando la AF y restaurando la disbiosis colónica más eficientemente que una dieta estándar; a pesar de que la dieta basada en leche fermentada de cabra también recuperó la integridad de la barrera intestinal, no mostró ningún efecto positivo adicional frente a la dieta estándar. Por tanto, la leche fermentada de cabra podría ser una estrategia nutricional prometedora para aliviar las alteraciones intestinales durante la AF y para reducir el impacto negativo de los suplementos de hierro en la salud intestinal.

Anaemia is a multifactorial syndrome characterised by a reduction in haemoglobin levels below homeostatic ranges, which vary according to age, gender and physiological conditions. It is estimated to affect one third of the global population with an increased prevalence in underdeveloped countries, where it imposes a considerable economic burden. Iron deficiency is the top leading cause of anaemia, causing approximately 50% of cases, and the most prevalent micronutrient deficiency worldwide. The lack of variety in therapeutic alternatives is one of the major problems when treating iron deficiency anaemia (IDA). Oral iron (iron supplements) is the first treatment option, with side effects outnumbering its beneficial aspects. Since iron absorption is fairly limited, non-absorbed iron from supplements is accumulated in the intestine, triggering oxidative stress and damaging the intestinal epithelium. Excess of iron also causes alterations in the gut microbiome. Not surprisingly, gastrointestinal alterations are common side effects produced by oral iron supplements, which in the end lead to the abandonment of treatment before iron deposits have been completely restored andto repetitive episodes of IDA. A considerable percentage of iron deficiency anaemias become chronic and refractory to treatment. Although it is well known that iron supplements exert a detrimental effect on gut health, questions regarding the alterations in the gut microbiome and the state of the intestinal epithelium and the gut barrier during IDA remain unanswered. The human intestine harbours the greatest and most diverse microbial community in the entire organism and causal relationships have been repeatedly established between the gut microbiome and the state of health. Some studies have investigated the microbial alterations in the context of IDA using classical methods and suggest that microorganisms might contribute to IDA through competition for iron with the host or by altering intestinal homeostasis. Most of these studies have focused on the microbial communities in the large intestine and faeces and did not use state-of-the-art sequencing methods. The gut microbiome is a key component of the intestinal barrier and intestinal dysbiosis has often been associated with alterations in the gut barrier. In physiological conditions, there is a wide variety of antigens, toxins and microorganisms in the intestinal lumen, and the gut barrier aims to prevent their leakage into the bloodstream. There is a considerable body of evidence to suggest that an increased leakage to extraintestinal tissues can trigger inflammation and lead to the aggravation of certain disorders. Despite the fact that iron shortage can impair DNA replication and cell cycle progression, therefore impairing the gut barrier, this aspect has been barely studied during IDA. Since addressing the deterioration of the gut microbiome and the intestinal barrier, if altered during IDA, would be one of the goals when optimising IDA therapies, fermented goat’s milk (FGM) was studied in this thesis as a nutritional tool to restore gut health. The higher nutritional value of goat’s milk along with its reduced risk of allergy compared to cow’s milk make it suitable to be used in specific scenarios. One of the nutrients showing the highest prebiotic potential are oligosaccharides, whose concentration is higher in goat’s milk compared to other animals. They are more structurally diverse and bear a close resemblance to breast milk oligosaccharides, the golden standard in relation to beneficial effects on intestinal health. On the other hand, fermentation improves digestibility as well as sensory properties and nutritional value of milk, increasing the availability of oligosaccharides and enhancing their prebiotic impact. Goat’s milk has been shown to increase iron bioavailability, but whether this effect might be microbiome-dependent is not known. Goat’s milk oligosaccharides have been reported to exert beneficial effects on the gut microbiome and the gut barrier integrity, but studies describing the effect of FGM are scarce. Therefore, a full characterisation of the alterations occurring in the gut microbiome along the gastrointestinal tract during IDA together with an in-depth analysis of the intestinal barrier have been included as the two hallmarks of intestinal health to study in this thesis. Moreover, the IDA recovering capacity of FGM was studied, along with its gut microbiome-shaping properties and its effects on the intestinal barrier. IDA was experimentally induced in an animal model through the use of an ironfree diet (iron free AIN-93G diet) over a period of 40 days. At the end of the induction period, part of the animals were sacrificed. Blood, serum, intestinal content and intestinal mucous layer samples and faeces were collected from each intestinal region (duodenum, jejunum, ileum, cecum and colon). The remaining animals underwent the treatment period using either a FGM-based diet or a standard diet along 30 additional days. At the end of the treatment period, animals were sacrificed and similar samples were collected. After confirming IDA had been correctly induced through the determination of haematological parameters, the gut microbiome was analysed in intestinal contents belonging to all segments (duodenum, jejunum, ileum, cecum and colon) and in faeces. In a first approach, 16S rRNA sequencing (amplicon sequencing) was used to identify the region showing the greatest dysbiosis. Amplicon sequencing revealed an intestinal dysbiosis occurred in response to IDA, with intensity increasing towards the most distal segments of the digestive tract (large intestine: cecum and colon). Predictive microbial functional analysis on 16S rRNA sequencing data revealed that the most enriched microbial pathways in the large intestine during IDA were related to short chain fatty acid (SCFA) metabolism. Determination of SCFA (butyrate, propionate and acetate) confirmed an increase during IDA, especially in the colon. Taxonomic analysis revealed an enrichment in members of the genus Clostridium in the large intestine, one of the major SCFA producers, which showed high positive correlations to butyrate and propionate levels in the colon of anaemic animals. Therefore, the colon was identified as the region showing the greatest dysbiosis during IDA. To take an in-depth look at the gumicrobiome alterations, whole metagenome sequencing was applied on colonic contents, revealing an enrichment in Clostridium species during anaemia, positively correlated to butyrate and propionate levels. Beside SCFA-related pathways being more abundant during IDA, nucleotide-producing pathways and bacterial load were also higher in the anaemic animals. Hence, key microbial species belonging to the genus Clostridium and key metabolites were identified as the main drivers of changes in the gut microbiome occurring in response to IDA. Given their well documented positive role on the intestinal epithelium, SCFA are likely to be part of microbial trade-off mechanisms taking place during IDA to compensate for systemic or intestinal disease-derived alterations. Analysis of the intestinal barrier on the colonic mucous layer through mRNAsequencing revealed an underdeveloped intestinal epithelium during IDA due to the downregulation of Gene Onthology terms related to the development and synaptic signalling within the enteric nervous system, the development of the digestive tract, cell junction assembly and cell integrity and organization of the extracellular matrix. Since collagen metabolism, as the major component of the extracellular matrix, is iron dependent, the expression of collagen-related genes and proteins was specifically analysed, finding also decreased levels during IDA. Due to the well stablished role of SCFA on the stabilization of intestinal hypoxia and the impact of hypoxia on the maintenance of the intestinal barrier, hypoxia target genes were analysed by quantitative PCR, showing no differences in expression levels between the control and the anaemic group. Therefore, the observed alterations in the intestinal barrier were hypoxiaindependent. Microbial translocation was studied in serum samples using two biomarkers: lipopolysaccharide (LPS) and bacteria-specific immunoglobulins. Increased LPS translocation along with an increased immune response against dysbiotic bacteria is in accordance with an impaired intestinal barrier during IDA. During the treatment period, the determination of haematological parameters revealed IDA was more efficiently recovered using a FGM-based diet compared to a standard one. The gut microbiome-modulating properties of FGM were studied in intestinal content samples belonging to all intestinal segments and faeces collected after the treatment period. FGM showed microbiome-modulating properties in the small and large intestine of control animals in line with this increased efficiency. The gut microbiome shaped by the FGM-based diet was slightly more diverse in terms of the number of species in the microbial community and more functionally active than that shaped by the standard diet, which is confirmed by a higher bacterial load in the colon of animals fed with FGM-based diet. As far as its microbiome-restoring properties are concerned, FGM-based diet and standard diet similarly restored gut dysbiosis in the small intestine, since alterations in this region were less noticeable. Gut dysbiosis in the colon was more efficiently restored by FGM-based diet compared to standard diet, confirming its prebiotic potential. None of the diets completely restored the microbiome in relation to the control group during the employed treatment period. Lastly, FGM did not show any additional positive effect on the gut barrier compared to the standard diet. Both diets restored the altered expression levels of key downregulated genes during IDA involved in the maintenance of the intestinal barrier. Absence of differences in serum LPS concentrations between control and anaemic groups fed with FGM-based diet or standard diet suggest a similar state of the intestinal barrier after treatment with both diets. This thesis analyses the alterations in the gut microbiome and intestinal barrier occurring in an animal model that represents a nutritional iron deficiency. With the discovery of an intense gut dysbiosis in the large intestine with an apparent compensatory role and an overall deteriorated intestinal barrier that leads to an increased leakage of microbial components, taking gut-protective approaches seems imperative when treating IDA. Fermented goat’s milk was studied in this context, recovering IDA and restoring the colonic microbiome more efficiently. Despite the fact that fermented goat’s milk also restored the integrity of the intestinal barrier, no additional positive effects were shown in this regard in comparison with the standard diet. Fermented goat’s milk is therefore a useful nutritional tool to ease intestinal alterations occurring during iron deficiency and to reduce the negative impact of iron supplements on the gut health.