Estudio de PARP-1 en células tumorales y células madre de cáncer de páncreas. Implicación en la resistencia tumoral y uso como diana terapéutica

Abstract

Los tumores gastrointestinales representan un grupo heterogéneo de enfermedades que generan 4,8 millones de casos y 3,4 millones de muertes al año, por lo que suponen una cuarta parte de la incidencia y el 35% de las muertes producidas por cáncer a nivel mundial. Entre estos, el cáncer de páncreas es el duodécimo más diagnosticado y la séptima causa de muerte, poseyendo una elevada letalidad en los países desarrollados. Uno de sus principales problemas es la ausencia de sintomatología específica, que desemboca en un diagnóstico tardío cuando el paciente se encuentra en estadios avanzados en los que ya se ha producido metástasis. Estos motivos, junto con el fenómeno de resistencia a los fármacos utilizados, provocan que la terapia actual sea ineficaz en este tipo tumoral, por lo que es necesario el descubrimiento de nuevas vías de tratamiento. La reparación de daños en el DNA es uno de los procesos relevantes en esta resistencia y la familia de enzimas PARP posee una gran importancia en esta reparación. Su principal miembro (PARP-1) actúa como un sensor molecular en varias rutas de reparación como la recombinación homóloga o la reparación de roturas en cadena simple (SSBR). Su función se realiza a través de la activación de proteínas implicadas en estos procesos mediante la PARilación, que es un proceso donde esta enzima modifica proteínas añadiendo residuos de ADP-ribosa. Adicionalmente, se ha observado que PARP-1 se encuentra implicada en tumorogénesis y progresión tumoral, habiéndose mostrado que el uso de inhibidores específicos frente a esta sensibilizaba a diferentes tipos de cáncer frente a fármacos quimioterápicos, incrementando así su efecto antitumoral. El objetivo principal de este trabajo de tesis doctoral era estudiar el papel que juega la expresión de PARP-1 en células tumorales derivadas de tumores gastrointestinales (específicamente, cáncer pancreático), y en las diferentes subpoblaciones como las células madre tumorales, y como la inhibición de PARP-1, tanto génica (con RNAi) como farmacológica con el Olaparib (OLA), puede mejorar los procesos de quimiorresistencia. Nuestros resultados mostraron que las líneas tumorales de tumores GI presentan una sobreexpresión de PARP-1 y como subpoblaciones dentro de estas, más resistentes a fármacos, poseen una expresión mayor de esta enzima comparado con tejidos no tumorales. Además, se mostró que los fármacos Doxorrubicina y Gemcitabina (GEM) eran capaces de producir la activación de PARP-1 en líneas de cáncer de páncreas. Al estudiar el silenciamiento génico de PARP-1 en una línea modificada que poseía la expresión de PARP-1 inhibida (6 veces menor), los resultados mostraron que la línea modificada (Panc02-L) poseía una mayor sensibilidad a varios de los fármacos citotóxicos probados (Gemcitabina, Doxorrubicina y Paclitaxel). Adicionalmente, la inhibición farmacológica de PARP-1 usando Olaparib generaba sinergia con el fármaco Gemcitabina, que se manifestó a través del incremento de la apoptosis celular en la combinación de ambos tratamientos. Además, la combinación de Olaparib con irradiación mostró un efecto sensibilizador de las células frente al fármaco Gemcitabina. Los diferentes estudios que llevamos a cabo de la implicación de PARP-1 en procesos relacionados con agresividad tumoral mostraron que la inhibición farmacológica o estable de PARP-1 en la línea Panc02 redujo la progresión tumoral, mostrando una menor clonogenicidad, migración y angiogénesis celular. Además, las células con esta represión de PARP-1 poseían una menor expresión de marcadores característicos de células madre tumorales como DNMT1 y SOX2 y eran más sensibles al tratamiento con Gemcitabina en ensayos de formación de tumorosferas tridimensionales. Estos interesantes resultados obtenidos in vitro, se replicaron en los experimentos in vivo con modelos murinos de tumores subcutáneos de páncreas derivados de Panc02, donde se demostró que el tratamiento simultáneo de Gemcitabina y Olaparib redujo en un 86% el volumen tumoral, un resultado significativamente mejor que el obtenido por los fármacos de forma individual (70 y 64% respectivamente). Además, los tumores inducidos a partir de la línea Panc02-L poseían un crecimiento 62% menor frente a la línea basal. Respecto a la supervivencia relativa de estos ratones, no existían diferencias significativas entre los grupos experimentales, aunque ninguno de los ratones inducidos a partir de la línea Panc02-L murió. El análisis de los tumores mostró una inducción de apoptosis temprana tras el tratamiento de los tumores Panc02 con Olaparib o en los tumores derivados de la línea Panc02-L. Este interesante efecto antitumoral provocado por la inhibición de PARP-1 mediante el Olaparib nos animó a tratar de potenciar el efecto de este utilizando la nanotecnología. Para esto, se encapsuló el Olaparib en nanoformulaciones de fosfato cálcico y se combinó con ácido ascórbico (AA), una vitamina que había mostrado efecto sinérgico con inhibidores de PARP-1 en otros tipos de cáncer. Los resultados de citotoxicidad mostraron que las nanoformulaciones que coencapsulaban Olaparib y ácido ascórbico (NP-ACP-OLA-AA) poseían un efecto citotóxico superior en tres líneas de adenocarcinoma pancreático testadas: Panc02, PANC-1 y MIA PaCa-2. Estas nanoformulaciones produjeron reducciones de la IC50 del 50, 56 y 28% en las líneas anteriormente nombradas frente al fármaco libre. Posteriormente, comprobamos que la combinación de ácido ascórbico en dosis no tóxicas y Olaparib era sinérgica, lo que podría explicar los interesantes resultados obtenidos en los estudios de toxicidad. Además, se mostró que los tratamientos con el fármaco libre y nanoencapsulado reducían la expresión proteica del marcador de proliferación Ki67, disminuyendo el crecimiento celular. La muertes producidas en las células tumorales por la nanopartícula y el fármaco libre se generaban mediante apoptosis, siendo este efecto 4 veces mayor en la primera. Este efecto se producía a través de la mayor genotoxicidad inducida por la nanopartícula, siendo este un 50% superior frente al fármaco libre tras 24 horas de tratamiento. Estos hallazgos fueron comprobados in vivo en ratones inmunodeprimidos NOD-SCID generados con células PANC-1. Los resultados mostraron que las nanoformulaciones redujeron el volumen tumoral en un 59,1% frente al control e incrementaba el efecto del fármaco libre, siendo su inhibición un 31% mayor. Este efecto podría justificarse por la acción sinérgica del Olaparib junto al ácido ascórbico y por el efecto EPR (efecto de permeabilidad y retención aumentada), que permite una mayor acumulación de nanopartículas en el tumor. El análisis histológico mediante hematoxilina-eosina y rojo alizarina demostró que las NPs llegaban al tejido correctamente, produciendo oquedades en el seno tumoral y generando una mayor inducción apoptótica frente al fármaco libre (comprobada mediante un ensayo TUNEL). En base a todos estos resultados, podemos concluir que este trabajo de tesis doctoral avanza en el estudio de PARP-1 como una nueva diana para el tratamiento antitumoral, demostrando que PARP-1 se encuentra sobreexpresada en líneas tumorales de tumores gastrointestinales, como el cáncer de páncreas y que su expresión se encuentra vinculada a procesos de quimiorresistencia y de malignidad celular tanto in vitro como in vivo. Al estudiar los efectos de su modulación, tanto la inhibición estable (a través de vectores virales) como la farmacológica se muestran como una terapia eficaz para permitir la sensibilización de las células tumorales pancreáticas frente al fármaco Gemcitabina. Finalmente, la generación de nanoformulaciones de Olaparib en combinación con ácido ascórbico permite que la sinergia mostrada por ambos fármacos mejore el efecto citotóxico del fármaco libre tanto in vitro como in vivo. En conclusión, la inhibición de PARP-1, sola o en combinación con Gemcitabina, puede convertirse en una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de tumores pancreáticos, ya que reduce la agresividad tumoral y permite evadir mecanismos de resistencia a quimioterapia. Además, las nuevas nanoformulaciones testadas podrían mejorar esta estrategia de tratamiento potenciando el efecto del Olaparib libre.

Gastrointestinal tumors represent a heterogeneous group of diseases that generate 4,8 million cases and 3,4 million deaths per year, accounting for a quarter of the incidence and 35% of cancer deaths worldwide. Among these, pancreatic cancer is the twelfth most diagnosed cancer and the seventh leading cause of death, with a high lethality rate in developed countries. One of its main problems is the absence of specific symptomatology, which leads to late diagnosis when the patient is in advanced stages and metastasis has already occurred. These reasons, together with the phenomenon of resistance to the drugs used, mean that current therapy is ineffective in this type of tumor, making it necessary to discover new avenues of treatment. DNA damage repair is one of the relevant processes in this resistance and the PARP family of enzymes is of great importance in this repair. Its main member (PARP-1) acts as a molecular sensor in several repair pathways such as homologous recombination or single-strand break repair (SSBR). Its function is performed through the activation of proteins involved in these processes by PARylation, which is a process where this enzyme modifies proteins by adding ADP-ribose residues. In addition, it has been observed that PARP-1 is involved in tumorigenesis and tumor progression, and it has been shown that the use of specific inhibitors against it sensitized different types of cancer against chemotherapy drugs, thus increasing their antitumoral effect. The main objective of this PhD thesis work was to study the role of PARP-1 expression in tumor cells derived from gastrointestinal tumors (specifically, pancreatic cancer), and in different subpopulations such as tumor stem cells, and how PARP-1 inhibition, both genetically (with RNAi) and pharmacologically with Olaparib (OLA), can improve chemoresistance processes. Our results showed that tumor lines of GI tumors overexpress PARP-1 and that subpopulations within these more drug-resistant tumor lines have a higher expression of this enzyme compared to non-tumor tissues. Furthermore, it was shown that the drugs Doxorubicin and Gemcitabine (GEM) were able to produce PARP-1 activation in pancreatic cancer lines. By studying PARP-1 gene silencing in a modified line that had inhibited PARP-1 expression (6-fold lower), the results showed that the modified line (Panc02-L) had increased sensitivity to several of the cytotoxic drugs tested (Gemcitabine, Doxorubicin and Paclitaxel). Additionally, pharmacological inhibition of PARP-1 using Olaparib generated synergy with the drug Gemcitabine, which was manifested through increased cell apoptosis in the combination of both treatments. In addition, the combination of Olaparib with irradiation showed a sensitizing effect of the cells to the drug Gemcitabine. The different studies we carried out on the involvement of PARP-1 in processes related to tumor aggressiveness showed that pharmacological or stable inhibition of PARP-1 in the Panc02 line reduced tumor progression, showing reduced cell clonogenicity, migration and angiogenesis. In addition, cells with this PARP-1 repression had lower expression of characteristic tumor stem cell markers such as DNMT1 and SOX2 and were more sensitive to gemcitabine treatment in three-dimensional tumorosphere formation assays. These interesting results obtained in vitro were replicated in in vivo experiments with murine models of Panc02-derived subcutaneous pancreatic tumors, where it was shown that simultaneous treatment with Gemcitabine and Olaparib reduced tumor volume by 86%, a significantly better result than that obtained by the drugs alone (70% and 64%, respectively). In addition, tumors induced from the Panc02-L line had 62% lower growth compared to the baseline. Regarding the relative survival of these mice, there were no significant differences between the experimental groups, although none of the mice induced from the Panc02-L line died. Analysis of the tumors showed an induction of early apoptosis after treatment of Panc02 tumors with Olaparib or in tumors derived from the Panc02-L line. This interesting antitumor effect caused by the inhibition of PARP-1 by Olaparib encouraged us to try to enhance the effect of Olaparib using nanotechnology. To do this, Olaparib was encapsulated in calcium phosphate nanoformulations and combined with ascorbic acid (AA), a vitamin that had shown synergistic effects with PARP-1 inhibitors in other types of cancer. Cytotoxicity results showed that nanoformulations coencapsulating Olaparib and ascorbic acid (NP-ACP-OLA-AA) had a superior cytotoxic effect on three pancreatic adenocarcinoma lines tested: Panc02, PANC-1 and MIA PaCa- 2. These nanoformulations produced IC50 reductions of 50, 56 and 28% in the cell lines versus free drug. Subsequently, we found that the combination of ascorbic acid at nontoxic doses and Olaparib was synergistic, which may explain the interesting results obtained in toxicity studies. In addition, treatments with the free and nanoencapsulated drug were shown to reduce protein expression of the proliferation marker Ki67, decreasing cell growth. The deaths produced in the tumor cells by the nanoparticle and the free drug were generated by apoptosis, this effect being 4 times greater in the former. This effect was produced through the greater genotoxicity induced by the nanoparticle, being 50% higher than that of the free drug after 24 hours of treatment. These findings were tested in vivo in immunosuppressed NOD-SCID mice generated with PANC-1 cells. The results showed that the nanoformulations reduced tumor volume by 59.1% compared to the control and increased the effect of the free drug, its inhibition being 31% greater. This effect could be justified by the synergistic action of Olaparib together with ascorbic acid and by the EPR effect (enhanced permeability and retention effect), which allows a greater accumulation of nanoparticles in the tumor. Histological analysis by hematoxylin-eosin and alizarin red showed that the NPs reached the tissue correctly, producing voids in the tumor sinus and generating a greater apoptotic induction compared to the free drug (proven by a TUNEL assay). Based on all these results, we can conclude that this doctoral thesis work advances the study of PARP-1 as a new target for antitumor treatment, demonstrating that PARP-1 is overexpressed in tumor lines of gastrointestinal tumors, such as pancreatic cancer, and that its expression is linked to chemoresistance and cellular malignancy processes both in vitro and in vivo. By studying the effects of its modulation, both stable inhibition (through viral vectors) and pharmacological inhibition are shown to be an effective therapy to allow the sensitization of pancreatic tumor cells against the drug Gemcitabine. Finally, the generation of Olaparib nanoformulations in combination with ascorbic acid allows the synergy shown by both drugs to enhance the cytotoxic effect of the free drug both in vitro and in vivo. In conclusion, PARP-1 inhibition, alone or in combination with Gemcitabine, may become an interesting therapeutic strategy for the treatment of pancreatic tumors, as it reduces tumor aggressiveness and allows evading chemotherapy resistance mechanisms. Furthermore, the new nanoformulations tested could improve this treatment strategy by enhancing the effect of free Olaparib.