Generación y evaluación in vivo de modelos bioartificiales de nervio periférico descelularizado de estructura y visco-elasticidad controladas

Abstract

En la presente Tesis Doctoral se han abordado dos principales estrategias para la generación de nuevos sustitutos de nervio periférico mediante ingeniería tisular, que podrían ser también aplicados a otros tejidos como la piel humana. En primer lugar, se evaluó el impacto del entrecruzamiento químico con el agente natural genipín en sustitutos de nervio descelularizados previamente descritos (métodos de Sondell y Roosens). El objetivo de esta primera estrategia fue generar matrices neurales con propiedades mecánicas mejoradas. El impacto de dos concentraciones de genipín (0.10 y 0.25%) en las matrices neurales descelularizadas fue evaluado a nivel histológico, biomecánico y biológico. En segundo lugar, se desarrollaron tres nuevos métodos de descelularización química con el objetivo de lograr un grado eficiente de eliminación del componente celular y una adecuada preservación de la estructura y composición de la matriz extracelular neural. Estos nuevos aloinjertos neurales descelularizados fueron sometidos a una completa caracterización ex vivo y posteriormente se evaluó su eficacia terapéutica in vivo. En el primer estudio, la histología confirmó las diferencias entre los métodos de Sondell y Roosens, y que el entrecruzamiento con genipín no indujo cambios histológicos evidentes, corroborando una adecuada preservación de la histología del nervio. La prueba biomecánica de tracción reveló que genipín mejoró las propiedades biomecánicas de los aloinjertos nerviosos descelularizados de Sondell y Roosens, siendo estos últimos los más comparables al comportamiento biomecánico de los nervios nativos utilizados como control. La evaluación de la biocompatibilidad de los aloinjertos nerviosos descelularizados realizada con células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo, y cultivadas sobre las matrices generadas, confirmó un alto grado de biocompatibilidad en todos los grupos. Los resultados fueron especialmente positivos en el grupo Roosens tratados con 0,10% de genipín. Finalmente, este estudio demostró que el uso de genipín podría ser una alternativa eficiente para mejorar las propiedades biomecánicas de los aloinjertos nerviosos descelularizados con un ligero impacto en la biocompatibilidad y el patrón histológico. Por estas razones, planteamos la hipótesis de que nuestros nuevos aloinjertos nerviosos descelularizados reticulados podrían ser una alternativa adecuada para futuros estudios preclínicos in vivo. En segundo lugar, se llevó a cabo una completa caracterización (histológica, ultraestructural, bioquímica, biomecánica y de biocompatibilidad) de los tres nuevos aloinjertos descelularizados de nervio periférico. En estos tres nuevos métodos químicos-enzimáticos se utilizaron diferentes concentraciones de detergentes (Tritón X-100, dodecil sulfato de sodio, desoxicolato de sodio) y enzimas (ARNasa y ADNasa) o, en su defecto, una solución de ácido perácetico, y se compararon con la eficacia del método de Sondell. El análisis histológico demostró una eliminación de material celular y mielina eficiente. El análisis de la matriz extracelular confirmo un alto grado de preservación de las fibras de la matriz, así como de la glicoproteína laminina, especialmente en los protocolos 1 y 2. Por último, no se observaron cambios significativos a nivel biomecánico, y las todas las matrices mostraron un alto grado de biocompatibilidad ex vivo. En función de los resultados ex vivo, se seleccionaron los protocolos 1 y 2, cuya eficacia regenerativa fue evaluada a las 15 semanas tras la reparación de defectos de 10-mm de longitud en el nervio ciático de ratas. Se utilizaron como controles, el método gold standard y sustitutos descelularizados obtenidos mediante la técnica de Sondell. El análisis clínico y funcional confirmó un grado de recuperación motora y sensitiva parcial y comparable al autoinjerto nervioso. La evaluación histológica, immunohistoquímica, ultraestructural y morfométrica confirmó la regeneración del tejido nervioso a lo largo de los injertos implantados, siendo, siendo el Protocolo 2 el protocolo el más eficaz, ya que los resultados fueron comparables al grupo autoinjerto, pero sin lograr superarlo. Finalmente, los resultados obtenidos en esta Tesis doctoral avalan por un lado, la utilización de genipín para generar sustitutos nerviosos descelularizados biocompatibles con propiedades biomecánicas mejoradas. Por otro lado, ha sido posible desarrollar un nuevo método de descelularización neural altamente eficiente, cuyos resultados in vivo fueron comparables al autoinjerto nervioso. Estos resultados sugieren que estos nuevos aloinjertos descelularizados podrían ser una terapéutica en la reparación quirúrgica de lesiones de nervios periféricos y podrían tener utilidad en la regeneración de otras estructuras como la piel humana.

In the present PhD Thesis were addressed two main strategies in order to generate new peripheral nerve substitutes by tissue engineering, which could also be applied to other tissues such as human skin. First, the impact of chemical crosslinking with the natural agent genipin on previously described decellularized nerve substitutes (Sondell and Roosens methods) was evaluated. The aim of this first strategy was to generate neural matrices with improved mechanical properties. The impact of two concentrations of genipin (0.10 and 0.25%) on decellularized neural matrices was evaluated at the histological, biomechanical and biological levels. Secondly, three new chemical decellularization methods were developed with the aim of achieving an efficient degree of cellular component removal and adequate preservation of neural extracellular matrix structure and composition. These new decellularized neural allografts were subjected to a complete ex vivo characterization and subsequently evaluated for their therapeutic efficacy in vivo. In the first study, histology confirmed the differences between the Sondell and Roosens methods, and the crosslinking with genipin did not induce obvious histological changes, corroborating adequate preservation of nerve histology. Biomechanical tensile testing revealed that genipin improved the biomechanical properties of decellularized Sondell and Roosens nerve allografts, being the latter the most comparable to the biomechanical behavior of native nerves used as controls. Evaluation of the biocompatibility of decellularized nerve allografts performed with adipose tissue-derived mesenchymal stem cells cultured on the generated matrices confirmed a high degree of biocompatibility in all groups. The results were especially positive in the Roosens group treated with 0.10% genipin. Finally, this study demonstrated that the use of genipin could be an efficient alternative to improve the biomechanical properties of decellularized nerve allografts with a slight impact on biocompatibility and histological pattern. For these reasons, we hypothesized that our new crosslinked decellularized nerve allografts could be a suitable alternative for future in vivo preclinical studies. Secondly, a complete characterization (histological, ultrastructural, biochemical, biomechanical and biocompatibility) of the three new decellularized peripheral nerve allografts was carried out. In these three new chemical-enzymatic methods, different concentrations of detergents (Triton X-100, sodium dodecyl sulfate, sodium deoxycholate) and enzymes (RNAase and DNAase) or, alternatively, a peracetic acid solution were used and compared with the efficacy of Sondell's method. Histological analysis demonstrated efficient removal of cellular material and myelin. Extracellular matrix analysis confirmed a high degree of preservation of matrix fibers as well as laminin glycoprotein, especially in protocols 1 and 2. Finally, no significant changes were observed at the biomechanical level, and all matrices showed a high degree of ex vivo biocompatibility. Based on the ex vivo results, protocols 1 and 2 were selected, whose regenerative efficacy was evaluated at 15 weeks after repair of 10-mm-gap defects in the sciatic nerve of rats. The gold standard method and decellularized substitutes obtained by the Sondell technique were used as controls. Clinical and functional analysis confirmed a degree of partial motor and sensory recovery comparable to the nerve autograft. Histological, immunohistochemical, ultrastructural and morphometric evaluation confirmed the regeneration of nerve tissue along the implanted grafts, being protocol 2 the most effective, since the results were comparable to the autograft group, but without surpassing it. Finally, the results obtained in this Doctoral Thesis support, on the one hand, the use of genipin to generate biocompatible decellularized nerve substitutes with improved biomechanical properties. On the other hand, it has been possible to develop a new highly efficient neural decellularization method, whose in vivo results were comparable to nerve autografting. These results suggest that these new decellularized allografts could be a therapeutic in the surgical repair of peripheral nerve injuries and could be potentially useful for the regenerative treatment of diseases affecting other tissues such as the human skin.