Genomic approaches to unravel the pathogenesis of Chagas disease

Abstract

La enfermedad de Chagas es una enfermedad infecciosa causada por el parásito Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es endémica de Latinoamerica donde el principal vector de transmisión son insectos hematófagos. Se estima que afecta a unas 6-7 millones de personas en todo el mundo ya que, debido a procesos como la migración y globalización, se ha extendido a zonas no endémicas. La enfermedad cursa con una fase aguda seguida de una fase indeterminada en la que la mayoría de individuos permanecen asintomáticos de por vida. Sin embargo, algunos pacientes pueden desarrollar la forma crónica de la enfermedad años después de la infección, manifestándose con sintomatología digestiva y/o cardíaca, siendo esta última la más frecuente y grave conocida como cardiomiopatía chagásica crónica. Dada las diferencias en el desarrollo de la infección en zonas endémicas así como la evolución diferencial a la forma crónica cardíaca, se ha sugerido la influencia de la variación genética del hospedador en la patogénesis de la enfermedad. La presente tesis doctoral se centra en el estudio del componente genético del hospedador mediante diferentes estrategias de análisis genético, para dilucidar su papel tanto en la infección como en el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica crónica. Para ello y con el objetivo de confirmar asociaciones previamente descritas, se realizaron estudios de genes candidatos para evaluar la relación de variantes genéticas localizadas en los genes IL6, IL17A e IL18, que codifican citoquinas implicadas en la respuesta inmune contra Trypanosoma cruzi. Dichas asociaciones se confirmaron para los genes IL17A e IL18, mientras que la relación de la variante del gen IL6 fue descartada. Sin embargo, la evaluación de variantes genéticas a lo largo de todo el genoma mejora la capacidad de identificación de variación asociada con la enfermedad de una manera no sesgada, para lo cual un estudio de asociación del genoma completo (GWAS, del inglés “genome-wide association studies”) supuso la herramienta de elección. Así, se realizó un GWAS en individuos procedentes de Colombia, Bolivia y Argentina que, junto con la información de población brasileña previamente publicada, se meta-analizó tanto para la susceptibilidad a la infección como para el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica crónica. Este análisis nos permitió identificar una asociación a nivel de significación genómica con la forma cardíaca cercana al gen SAC3D1, siendo la primera asociación genómica identificada en esta enfermedad. Por otro lado, dada la mezcla de las poblaciones ancestrales Nativo Americana, Europea y Africana presente en las poblaciones latinas, se evaluó la relación de estos bloques de ascendencia con la susceptibilidad a la enfermedad de Chagas. Para esto se realizó un análisis de mapeo por mezcla en la cohorte colombiana. Se identificó una asociación de protección de la ascendencia Nativo Americana con la susceptibilidad a la infección en la región del complejo mayor de histocompatibilidad, en contraposición de la ascendencia Europea que resultó de riesgo, poniendo de manifiesto el componente evolutivo en la relación parásitohospedador de estas poblaciones. En esta región genética se localizan numerosos genes implicados en la respuesta inmunológica, entre los que cabría destacar los genes HLA, que tienen una gran transcendencia en el reconocimiento antigénico, y algunos miembros de la familia de los TRIM, conocidos por su papel en la respuesta inmune frente a patógenos. Finalmente, se llevó a cabo un análisis de rasgos cuantitativos de metilación (mQTLs, del inglés “methylation quantitative trait loci”) en la región genómica identificada en el GWAS. Con esta estrategia se analizó el efecto de la variación genética en los patrones de metilación de un subconjunto de pacientes procedentes de Bolivia. Entre los resultados más importantes destacamos aquellos mQTLs en genes que se han relacionado previamente con caracteres hematológicos y cardiovasculares. Además, identificamos mQTLs del gen CCDC88B, que tiene un papel relevante en el proceso inflamatorio. Este gen había sido previamente identificado como diferencialmente metilado y expresado en tejido cardiaco de pacientes con cardiomiopatía chagásica crónica, lo cual pone de manifiesto su importancia en la patogénesis de la enfermedad. Nuestros resultados confirmaron la influencia de los genes de esta región, destacando la funcionalidad de los mismos más allá de la variación en la secuencia del ADN. Adicionalmente, la identificación de genes previamente identificados en tejido cardiaco, pone de manifiesto la importancia del uso de tejidos más accesibles en la identificación de biomarcadores. Los resultados presentados en esta tesis doctoral destacaron el papel de la genética del hospedador en el desarrollo de la enfermedad de Chagas. Esto, junto con los análisis de metilación y expresión global que se están realizando en estas muestras, representan un avance en el conocimiento de la patogénesis de esta enfermedad tropical desatendida.

Chagas disease is an infection caused by the parasite Trypanosoma cruzi. This disease is endemic form Latin America, where the main transmission vectors are hematophagous bugs. It is estimated that the infection affects 6-7 million people around the world, where it has been extended to non-endemic areas given migratory movements and globalization. Chagas disease has an acute phase followed by an indeterminate phase, and the majority of individuals remain asymptomatic for life. Nevertheless, some patients could develop the chronic form of the disease even years after the infection, which manifests with digestive and/or cardiac symptomatology. The latter the most frequent and severe form of the disease is known as chronic Chagas cardiomyopathy. Given the inter-individual differences in the infection in endemic regions as well as the differential development of the chronic cardiac form, it has been suggested the influence of the host genetic component in the pathogenesis of the disease. The present doctoral thesis focused in the analysis of the host genetic component through different genetic analysis approaches, in order to elucidate its role in the infection and the progress to the chronic Chagas cardiomyopathy. In order to confirm previously described associations, candidate gene studies were performed to assess genetic variants located in the IL6, IL17A and IL18 genes, which encode cytokines with relevance in the immune response against Trypanosoma cruzi. The associations were confirmed for the IL17A and IL18 variants, while it was discarded for the IL6 gene variant. The assessment of genetic variation throughout the entire genome improves the capacity of identifying disease associations in an unbiased fashion; therefore a genome-wide association study (GWAS) was the strategy of choice. For this, Colombian, Bolivian and Argentinian individuals’ genomic data was meta-analyzed with previously published data from the Brazilian population. This analysis was carried out for the susceptibility to the infection and the development of chronic Chagas cardiomyopathy. Using this strategy, it was possible to identify an association at genomic significance level with the chronic cardiac form in the vicinity of the SAC3D1 gene, being this the first genomic association identified for the disease. On the other hand, given the admixture of Native American, European and African ancestries of the Latin American populations, the relation among ancestry genetic blocks and the susceptibility to Chagas disease was assessed. Thus, an admixture mapping analysis in the Colombian population was performed. This approach revealed a protective association of the Native American ancestry with the susceptibility to the infection located in the major histocompatibility complex region. In contrast, the European ancestry showed a risk association with the disease, highlighting the evolutionary component in the parasite-host relationship of these populations. The HLA genes and the TRIM gene family were highlighted in this locus, which are of great importance for antigenic recognition and their contribution in the immune response against pathogens. Finally, a methylation quantitative trait loci (mQTLs) analysis was performed in the significant genomic region from the GWAS. This strategy allowed us to evaluate the effect of the genetic variation in the methylation patterns in a subset of individuals from Bolivia. Significant mQTLs were identified, including the CCDC88B, which is an important player in the inflammatory process. Interestingly, a previous analysis in chronic Chagas cardiomyopathy patients revealed this gene as differentially methylated and expressed. Our results highlighted the functionality of the genes within this region beyond the variation in the DNA sequence. In addition, the exposure of genes previously reported in cardiac samples, highlighted the importance of using more accessible tissues in the identification of disease biomarkers. The results presented in this doctoral thesis emphasized the role of the host genetics in the development of Chagas disease. This, together with the global methylation and expression analyses being carried out, represents an advance in the knowledge of the pathogenesis of this neglected tropical disease.