Desarrollo de nuevas estrategias de detección de ácidos nucleicos para diagnóstico molecular

Abstract

El diagnóstico molecular basado en ácidos nucleicos ha mostrado ser de vital importancia en el diagnóstico de enfermedades como el cáncer o enfermedades infecciosas. El desarrollo de sistemas que permitan detectar ácidos nucleicos y que confieran ciertas ventajas sobre los sistemas actualmente disponibles es de gran interés. Con el objeto de aportar nuevos enfoques y contribuir a algunos de estos retos, en esta tesis doctoral se aplican diferentes métodos de detección de ácidos nucleicos. En primer lugar, se integra el marcaje por química dinámica (Dynamic Chemistry Labelling, DCL), basado en el uso de ácidos nucleicos peptídicos (Peptide Nucleic Acids, PNAs) abásicos y SMART-Nucleobases para la lectura de ácidos nucleicos con resolución de una base, junto con nanopartículas de poliestireno, que destacan por su versatilidad y estabilidad. Con este enfoque se estudian variaciones de nucleótido en secuencias sintéticas del oncogén KRAS y miR-122 en fluidos biológicos como plasma humano mediante citometría de flujo. En segundo lugar, se combina la DCL con la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) detectando secuencias α-satélite en líneas tumorales humanas, abriendo la posibilidad de estudiar polimorfismos en estas secuencias y se plantea cómo esta nueva aplicación podría ser utilizada para llevar a cabo secuenciación por química dinámica in situ. Además, se realiza una primera aproximación para detectar mutaciones puntuales en ARN mensajero de KRAS in situ en líneas tumorales humanas. Finalmente, en esta tesis se aplica el método isotermal de amplificación C2CA (Circle-To-Circle Amplification), basado en varias rondas de Rolling Circle Amplification (RCA), para detectar ARN viral del virus del Zika y evaluar la eficacia de dos fármacos antiflavivirales en células sanguíneas periféricas mononucleares infectadas. En definitiva, en esta tesis doctoral se exploran técnicas y métodos con el objeto de aportar nuevos enfoques y mejoras en la detección de ácidos nucleicos para contribuir al diagnóstico molecular.

Nucleic acid-based molecular diagnosis has gained special importance in public health, especially in the diagnosis of diseases such as cancer, or in the diagnosis of infectious diseases. The development of systems that allow nucleic acids detection and that confer certain advantages over currently available systems is of great interest. In order to provide new approaches and contribute to some of these challenges, this doctoral thesis explores different nucleic acid detection methods are applied in order to contribute to these advantages. First, Dynamic Chemistry Labeling (DCL) is integrated, based on the use of abasic peptide nucleic acid (PNA) probes and SMART-Nucleobases for the reading of nucleic acids with single-base resolution, together with polystyrene nanoparticles, which stand out for their stability and versatility. Using this approach, nucleotide variations are studied in synthetic sequences of the KRAS oncogene and miR-122 in biological fluids such as human plasma using flow cytometry. Secondly, DCL is combined with the fluorescent in situ hybridization (FISH) technique for detecting α-satellite sequences in human tumor cell lines, opening the possibility of studying polymorphisms in these sequences and considering how this new application could be applied to perform sequencing by in situ DCL. Furthermore, a first approach has been developed to detect KRAS messenger RNA point mutations in situ in human tumor cell lines. Finally, in this thesis, the isothermal C2CA (Circle-To-Circle Amplification) method, based on several rounds of Rolling Circle Amplification (RCA), is applied to detect viral RNA of the Zika virus and evaluate the efficacy of two antiflaviviral drugs in infected peripheral blood mononuclear cells. In short, this doctoral thesis explores techniques and methods in order to provide new approaches and improvements in the detection of nucleic acids in order to contribute to molecular diagnosis.