Role of interferon-induced PKR as predictive biomarker and anti-cancer stem cells properties of interferon

Abstract

Colon cancer and malignant melanoma figure among the leading causes of morbidity and mortality whose incidence is increasing worldwide. Currently, available cytotoxic treatment options show low response rates, significant side effects and low/medium impact on survival, thus emphasizing the need for more effective therapies and new predictive biomarkers that could be achieved by a personalized treatment, based on the individual tumours molecular profile. The correct and early diagnosis of cancer is essential for adequate and effective treatment because every cancer patient requires a specific treatment regimen, which encompasses one or more modalities such as surgery, radiotherapy and/or chemotherapy. Despite the success of new treatments, most patients progress due to the presence of intraand intertumoral heterogeneity conferring resistance and thus disease relapse. Factors contributing to heterogeneity include interactions with the microenvironment, inflammatory response, genetic mutations and the presence of cancer stem cells subpopulations (CSCs). This small cell subpopulation is characterized, among others, by relative quiescence, longevity, slow cell cycle progression and accordingly high resistance towards radiation and cytotoxic drugs, which finally accounts for metastasis formation and local relapse after long periods of dormancy. Therefore, to prevent cancer relapse, new therapeutic effective strategies against CSCs are required; and the search for specific drugs with low-toxicity and new predictive and pronostic biomarkers are still a very attractive approach. In this way, with the aim of searching new predictive biomarkers for cancer patients, our group has identified the protein kinase, PKR. The protein kinase R (PKR, also called EIF2AK2) is an interferon-inducible double-stranded RNA protein kinase with multiple effects on cells that plays an active part in the cellular response to numerous types of stress. PKR has been extensively studied and documented for its relevance as an antiviral agent and a cell growth regulator. PKR has been previously identified by our group as a therapeutic target of the chemotherapeutic drug 5-Fluorouracil (5-FU), inducing tumor cell death by apoptosis in a complementary and independent manner to the tumor suppressor p53. In addition, PKR is regulated by a non-coding pre-mir886 (nc886), which has been identified in serum of patients with metastases having high potential to be a detectable biomarker in liquid biopsies. Our data show the great variability in PKR expression levels and localization between tumor samples and healthy tissues in patients with metastatic colon cancer (plasma and colon epithelium). The expression levels and localization of PKR together with the expression of nc886 have allowed the identification of groups of patients with different responses to treatment based on the use of 5-FU, supporting the great potential of this protein and the pre-microRNA that regulates it as possible predictive biomarkers in different types of cancer. In addition, PKR is induced by Interferon type I (IFN), a cytokine widely known for their antiviral and antitumor activity. In fact, non metastatic high-risk melanoma is still treated with high dose of Interferon alpha (IFN-α) with a significant improvement in Disease Free Survival in patients through a mechanism that is not yet fully understood. In this thesis, we have analyzed the effect of low and high dose of IFN-α-treatment over melanospheres enriched in CSCs subpopulations, demonstrating that this cytokine has a potent antitumor action against these subpopulations both in vitro and in vivo, which contributes to deep in the mechanism of action of these cytokines and to devise new therapies based on effective combinations against these resistant populations. Since new immunotherapies are being imposed in melanoma and other solid tumors, as well as different combinations are under clinical trial to avoid resistances, the efficacy of interferons over CSCs even at low doses with fewer side effects, should be considered as a potentially important combination treatment against the relapse of the disease in oncology. Recently, cellular communication by extracellular vesicles has gained great importance for its likely involvement in cancer. Tumor-derived exosomes are abundant in the body fluids of cancer patients, including those with malignant melanoma, and are involved in several processes such as tumor initiation, progression and tumoral metastasis. In this work, we have demostrated the IFN- α modulation on specific traffic vesicles and exosomes production from melanoma stem cell, suggesting their role of potential biomarkers in novel cancer therapies. Moreover, for the first time, we have found significant differences on the metabolomic profile of exosomes derived from melanoma CSCs as compared with the population of differentiated IFN- α - treated cells. The metabolomic characterization of exosomes opens the door for the discovery of prognosis and diagnosis biomarkers of malignant melanoma with a clear translational and clinical application.

El cáncer de colon y el melanoma maligno figuran entre las principales causas de morbilidad y mortalidad cuya incidencia está aumentando en todo el mundo. En la actualidad, las opciones de tratamientos citotóxicos disponibles muestran bajas tasas de respuesta, importantes efectos secundarios y un bajo/medio impacto en la supervivencia, lo que pone de manifiesto la necesidad de terapias más eficaces y la detección de nuevos biomarcadores predictivos que podrían lograrse mediante un tratamiento personalizado, basado en el perfil molecular individual de los tumores. El correcto y precoz diagnóstico del cáncer es esencial para un tratamiento adecuado y eficaz, ya que cada paciente requiere un régimen de tratamiento específico, que abarca una o más modalidades tales como la cirugía, la radioterapia y/o la quimioterapia. A pesar del éxito de los nuevos tratamientos, la mayoría de los pacientes progresan debido a la presencia de heterogeneidad intra e intertumoral que confiere resistencia y por tanto, la recaída de la enfermedad. Los factores que contribuyen a la heterogeneidad son principalmente las interacciones con el microambiente, la respuesta inflamatoria, las mutaciones genéticas y la presencia de subpoblaciones de células madre cancerígenas (CSC). Esta pequeña subpoblación celular se caracteriza, entre otras, por su quiescencia, longevidad, lenta progresión del ciclo celular y, en consecuencia, alta resistencia a la radiación y a los fármacos citotóxicos, lo que finalmente explica la formación de metástasis y la recaída local tras largos periodos de inactividad. Por tanto, para prevenir la recaída del cáncer, se requieren nuevas estrategias terapéuticas eficaces frente a CSC; es por ello, que la búsqueda de fármacos específicos de baja toxicidad y de nuevos biomarcadores predictivos y pronósticos sigue siendo un enfoque muy atractivo. De este modo, con el objetivo de buscar nuevos biomarcadores predictivos para los pacientes con cáncer, nuestro grupo ha identificado la proteína quinasa, PKR. La proteína quinasa R (PKR, también llamada EIF2AK2) es una proteína quinasa de ARN de doble cadena inducida por interferón, con múltiples efectos en las células, que participa activamente en la respuesta celular a numerosos tipos de estrés. PKR ha sido ampliamente estudiada y documentada por su importancia como agente antiviral y regulador del crecimiento celular. PKR ha sido identificada previamente por nuestro grupo como una diana terapeútica del fármaco quimioterapéutico 5-Fluorouracilo (5-FU), induciendo la muerte de las células tumorales por apoptosis de una forma independiente y complementaria al supresor de tumores p53. Además PKR está regulada por un pre-mir886 no codificante (nc886), que ha sido identificado en suero de pacientes con metástasis teniendo alto potencial para ser un biomarcador detectable en biopsias líquidas. Nuestros datos muestran la gran variabilidad en los niveles de expresión y localización de PKR entre muestras tumorales y los tejidos sanos en pacientes con cáncer de colon metastásico (plasma y epitelio de colon). Los niveles de expresión y localización de PKR junto con la expresión del nc886 han permitido identificar grupos de pacientes con diferentes respuestas al tratamiento basado en el uso del 5-FU apoyando el gran potencial de esta proteína, y el pre-microRNA que la regula como posibles biomarcadores predictivos en diferentes tipos de cáncer. Además, PKR es inducida por el Interferón tipo I (IFN), una citoquina ampliamente conocida por su actividad antiviral y antitumoral. De hecho, el melanoma no metastásico de alto riesgo sigue siendo tratado con altas dosis de Interferón alpha (IFN- α) con una mejora significativa en la Supervivencia Libre de Enfermedad en los pacientes a través de un mecanismo que aun no es entendido del todo. En la presente tesis, hemos analizado el efecto del tratamiento con dosis bajas y altas de IFN-α sobre melanosferas enriquecidas en subpoblaciones de CSCs demostrando que dicha citoquina tiene una potente acción antitumoral frente a estas subpoblaciones tanto in vitro como in vivo, lo que contribuye a profundizar en el mecanismo de acción de estas citoquinas y a idear nuevas terapias basadas en combinaciones eficaces contra estas poblaciones resistentes. Dado que se están imponiendo nuevas inmunoterapias en el melanoma y otros tumores sólidos, así como diferentes combinaciones están en fase de ensayo clínico para evitar resistencias, la eficacia de los interferones sobre las CSCs, incluso a dosis bajas y con menos efectos secundarios, debería considerarse como un tratamiento combinado potencialmente importante contra la recaída de la enfermedad en oncología. Recientemente, la comunicación celular mediante vesículas extracelulares ha cobrado gran importancia por su implicación en cáncer. Los exosomas derivados del tumor son abundantes en los fluidos corporales de los pacientes oncológicos, incluidos los que padecen melanoma maligno, y están envueltos en numerosos procesos como el inicio, la progresión y la metástasis tumoral. En este trabajo, hemos demostrado la modulación del IFN-α en el tráfico de vesículas específicas y producción de exosomas de células madre de melanoma, sugiriendo su papel como potenciales biomarcadores en nuevas terapias contra el cáncer. Además, por primera vez, se han encontrado diferencias significativas en el perfil metabolómico de los exosomas derivados de las CSC de melanoma en comparación con la población de células diferenciadas tratadas con IFN- α. La caracterización metabolómica de los exosomas abre una puerta al descubrimiento de biomarcadores de pronóstico y diagnóstico del melanoma maligno para su enfoque clínico y traslacional.