Nanoestructuras híbridas bioinorgánicas. Aplicaciones en nanomedicina.

Abstract

La presente Tesis Doctoral se enmarca en el estudio del potencial que presenta el uso de proteínas para la creación de nanoestructuras híbridas bioinorgánicas con propiedades fascinantes y posibles aplicaciones en el campo de la nanomedicina. Los resultados experimentales obtenidos y la discusión de los mismos se presentan en esta memoria divididos en 6 capítulos. En el primer capítulo, la introducción, se revisan los conceptos básicos del tema de investigación en el que se enmarca la presente Tesis Doctoral y la motivación del mismo en el contexto actual. Inicialmente, se expone una idea general de la relación existente entre la nanotecnología, la química y la medicina. Posteriormente, se lleva a cabo una presentación de las aplicaciones que presenta la nanotecnología en medicina, incluyendo conceptos claves como el diagnóstico por imagen, la liberación controlada de fármacos, la hipertermia o la medicina regenerativa. A continuación, se exponen otras ideas básicas de esta Tesis Doctoral, como son la definición de biomateriales, de agentes teranósticos o el uso de proteínas para la preparación de materiales híbridos bioinorgánicos. Además, se presentan de manera general las propiedades más características de las proteínas apoferritina y β-lactoglobulina (proteínas en las que se centra este trabajo), así como de las fibras proteicas de tipo amiloide. Finalmente, se concluye el capítulo con los objetivos que se han pretendido alcanzar en esta Tesis Doctoral. En el segundo capítulo, se presenta un nuevo nanotransportador teranóstico desarrollado durante la presente Tesis, usando las ventajas que presenta la estructura única de la proteína apoferritina. Esta proteína es efectiva para la encapsulación de nanopartículas de maghemita (nanopartículas de óxido de hierro con propiedades magnéticas) así como del fármaco doxorrubicina (antibiótico antitumoral). La incorporación simultánea de nanopartículas de maghemita y doxorrubicina se ha conseguido mediante dos métodos: co-encapsulación y unión superficial. Las nanopartículas de maghemita recubiertas con la proteína apoferritina son una manera efectiva de conseguir imágenes de contraste MRI de larga duración en hígado, como ha sido previamente reportado por nuestro grupo de investigación. Durante el transcurso de esta Tesis, se ha puesto de manifiesto que pueden servir, además, como un sistema de liberación de fármacos anticancerígenos. En concreto, se muestra que la apoferritina conteniendo simultáneamente la maghemita y la doxorrubicina libera el fármaco durante un período de 10 a 25 días dependiendo de las condiciones experimentales. Por lo tanto, este nanotransportador “doxo-Apomaghemita” podría encontrar aplicaciones en el campo de la “medicina teranóstica”, combinando simultáneamente dos componentes de diagnosis y terapia en un único nanovector. En el tercer capítulo, hemos puesto de manifiesto por primera vez la formación de fibras de tipo amiloide para la proteína apoferritina. La morfología, el tamaño y la rigidez de estas estructuras unidimensionales (1D) son comparables a las formadas por la proteína β-lactoglobulina, una proteína que se utiliza frecuentemente como modelo en el estudio de las proteínas fibrilares de tipo amiloide. La apoferritina globular tiene un tamaño nanométrico de 12 nm y es capaz de disociarse primero para auto-ensamblarse posteriormente y formar estructuras 1D de tamaño micrométrico después de ser expuesta a un proceso adecuado de desnaturalización. Dependiendo de las condiciones experimentales, se obtienen fibras con diferentes longitudes y morfologías. Además, hemos identificado y caracterizado las diferentes estructuras implicadas en el proceso de formación de las fibras de apoferritina, desde pequeños agregados u oligómeros hasta las fibras maduras. El empleo de diversas técnicas (AFM, SDS-PAGE, CD y FLIM-PIE) proporcionan evidencias convincentes de que el desensamblaje de la proteína así como su hidrólisis son esenciales para la formación de las fibras y que fragmentos de péptidos pequeños (<5 KDa) participan en la formación de las mismas. El estudio por AFM, TEM y las medidas de DLS nos permitieron resolver e identificar diferentes estados individuales del proceso de formación de las fibras. Además, la técnica novedosa de FLIM-PIE proporciona información muy valiosa a nivel molecular que permite la identificación de los diferentes tipos de oligómeros. Los resultados mostrados en este capítulo abren una nueva perspectiva en la comprensión del proceso de formación de fibras de la proteína apoferritina. Este tipo de estructuras proteicas fibrilares está adquiriendo gran importancia debido a sus propiedades únicas y sus amplias aplicaciones en biología (están relacionadas con diversas enfermedades neurodegenerativas) y en nanotecnología (como plantillas para la fabricación de nanoestructuras híbridas bioinorgánicas). En el cuarto capítulo, mostramos cómo las subunidades peptídicas H (heavy) y L (light) que conforman la proteína apoferritina (con una coincidencia en su secuencia peptídica de sólo el 54-57%), son capaces de controlar la quiralidad final de las fibras resultantes. De esta manera, hemos comparado las fibras formadas en dos casos diferentes: partiendo de apoferritina recombinante humana formada por un 100% de subunidades H y partiendo de apoferritina recombinante humana formada por un 100% de cadenas L. La quiralidad que se observó fue de casi un 100% dextrógira en el caso de las fibras formadas a partir de la apoferritina L y casi un 100% levóriga en el caso de utilizar la apoferritina H. Por primera vez se ha mostrado que una proteína globular, como es el caso de la apoferritina, forma fibras con una quiralidad dextrógira. Usualmente las fibras formadas a partir de proteínas globulares presentan una quiralidad levógira y sólo se ha mostrado esta quiralidad dextrógira cuando se parte de pequeños péptidos. Hemos estudiado la estructura y morfología de dichas fibras mediante la combinación de diferentes técnicas. Parámetros morfológicos como la longitud, la altura media o la periodicidad se han evaluado mediante un análisis estadístico por AFM. La tomografía electrónica de transmisión ha proporcionado resultados muy novedosos tales como que las fibras de apoferritina presentan un patrón común con una subestructura compuesta por dos filamentos con una disposición helicoidal. Además, se ha extraído la distancia que hay entre estos dos filamentos así como la anchura total de las fibras. También se ha obtenido el valor de la periodicidad que concuerda con el valor medio obtenido mediante el análisis estadístico por AFM. El estudio mediante HR-TEM y SEM ha permitido confirmar que las fibras están formadas a su vez por dos filamentos. Por otro lado, las medidas de CD, FTIR y WAXS proporcionaron información acerca de la estructura secundaria de las diferentes fibras proteicas, confirmando una estructura de tipo β-amiloide. Estos resultados ofrecen la posibilidad de usar el control de la quiralidad para acceder a nuevas morfologías o nanoestructuras peptídicas y muestran a su vez cómo la secuencia peptídica de estas estructuras puede controlar la morfología final de las fibras. Todos estos mecanismos podrían tener grandes implicaciones en el campo de las nanoestructuras 1D funcionales. En el quinto capítulo, hemos preparado nanofibras fluorescentes 1D usando tanto la proteína apoferritina como la β-lactoglobulina. La estructura proteica con forma fibrilar es rica en grupos funcionales que permiten una funcionalización química con diversos quantum dots (QD), así como con diferentes marcadores de tipo Alexa fluor (AF), lo cual conduce a la formación de fibras híbridas fluorescentes con diferentes longitudes de onda de emisión, del verde al infrarrojo cercano, dependiendo del QD y el AF que se acopla. Además, en las fibras que contienen el par AF488 y AF647, se puede observar una transferencia de energía eficiente (FRET) por parte del donor covalentemente enlazado (AF488) hacia el aceptor (AF647). Por otro lado, también obtenemos información complementaria de las estructuras y las propiedades luminiscentes de estos nanomateriales híbridos mediante la combinación de AFM y microscopía de fluorescencia con súper-resolución. Mientras que la imagen tomográfica permite determinar la estructura de la fibra, la imagen de súper-resolución (en uno o dos colores) permite la identificación de los QDs emisivos y no emisivos. Por lo tanto, se pone de manifiesto que estos nanomateriales y en concreto las fibras de apoferritina son una nueva plantilla muy prometedora para la síntesis de materiales híbridos multifuncionales. En el sexto capítulo, hemos preparado nanofibras híbridas metálicas usando tanto la proteína apoferritina como la β-lactoglobulina como plantillas. Hemos demostrado que las fibras de apoferritina presentan la habilidad de ensamblar diferentes nanopartículas metálicas, de manera similar a las fibras de β-lactoglobulina. De esta manera se han preparado nanofibras metálicas 1D con diferentes propiedades ópticas y magnéticas mediante la unión de diferentes nanopartículas de oro y de maghemita a las fibras de apoferritina y β-lactoglobulina. Estos nanomateriales híbridos podrían encontrar aplicaciones muy atractivas como sensores o como agentes de contraste para MRI así como para el tratamiento por hipertermia. En este capítulo también se reporta la preparación de nanopartículas de oro, plata y paladio “in situ” mediante reducción química en presencia de las fibras amiloides. Por lo tanto, hemos puesto de manifiesto que las fibras de tipo amiloide de apoferritina pueden servir como plantillas para la preparación de nanopartículas metálicas con potenciales aplicaciones en nanomedicina y/o nanotecnología. Estos resultados muestran la naturaleza versátil de estas estructuras y su gran interés para la preparación de nanoestructuras híbridas 1D con propiedades nuevas y/o mejoradas. Por último, en las conclusiones hacemos un resumen del trabajo desarrollado durante esta Tesis Doctoral y extraemos y comentamos los resultados más significativos.