Glycosyl and alkyl modifications on potential therapeutic drugs targeting parasitic, cancer and neurodegenerative diseases

Abstract

La presente tesis doctoral está centrada en el desarrollo de conjugados de potenciales fármacos con carbohidratos y cadenas lipófilas. Estos compuestos que se han considerado “Lead” a optimizar se basan en ligandos de ADN en G-quadruplex (G4) (véase la siguiente ilustración) y en tres fenoles naturales, tirosol (Tyr), hidroxitirosol (HT) y resveratrol (RES). En primer lugar, hemos diseñado y sintetizado conjugados de azúcares y ligandos de G4 como posibles agentes anticancerígenos y antiparasitarios. La idea es obtener compuestos con mejores propiedades farmacológicas, mejor afinidad hacia sus dianas terapéuticas y mejor selectividad hacia células tumorales y parásitos protozoarios. La diana terapéutica son los ADN en G-quadruplex (G4), estructuras secundarias que se forman en secuencias del ADN y ARN ricas en guaninas vinculadas a la regulación de importantes procesos biológicos, incluidos la replicación y la transcripción de determinados genes. Se ha sintetizado la nueva familia de ligandos de G-quadruplex basadas en las naftalendiimidas (NDI) en colaboración con el Prof. Mauro Freccero (Universidad de Pavia, Italia). La preparación de los conjugados se realizó por medio de la cicloadición 1,4- de Huisgen (click chemistry) usando como precursores azidoazúcares y un NDI modificado con un alquino. Los carb-NDI se unen fuertemente a sus dianas y muestran selectividad frente a dúplex de ADN. La presencia del carbohidrato reduce ligeramente la afinidad por las dianas si se compara con el control aglicona-NDI pero aún así también son buenos ligandos de las secuencias mayoritarias de Trypanosoma brucei y Leishmania major, encontradas mediante una búsqueda in silico de la incidencia y función biológica de G4 en sus respectivos genomas, y de la secuencia del telomero humano. Se han realizado estudios de entrada celular de los ligandos carb-NDI mediante citometría de flujo y espectroscopía de fluorescencia en diferentes líneas cancerígenas y no tumorales. Pudimos observar diferencias importantes entre el control sin azúcar, que se localizan en el núcleo de manera casi instantánea independientemente de la temperatura, y los conjugados carb-NDI, que también se acumulan en el núcleo pero más lentamente. En este último casi su entrada depende de la temperatura, tiempo de incubación y del tipo de unión del carbohidrato. Empleando incubaciones con diferentes inhibidores de GLUT (transportadores de glucosa), se observó que para la entrada de los carb-NDI en las células se producía, al menos parcialmente, mediante GLUT4. Se observó una correlación entre entrada celular y viabilidad de las células tumorales tras incubación con los derivados NDI. El control aglicona-NDI que entra más rápidamente es el más citotóxico, pero no el más selectivo hacia las líneas cancerígenas. Los carb-NDI mostraron actividad antiproliferativa en el rango submicromolar y son potenciales candidatos a ser ensayados in vivo. La actividad antiparasitaria de los carb-NDI fue destacable en los diferentes parásitos, en especial en Trypanosoma brucei y Leishmania major donde se observaron algunas diferencias dependiendo del carbohidrato y del tipo de unión. En todos los casos, la fluorescencia inherente en los compuestos permitió localizar los conjugados principalmente en el núcleo y el kinetoplasto usando microscopía confocal. Los ensayos de toxicidad in vivo en un modelo de pez cebra demostraron que los compuestos con carbohidrato eran menos tóxicos que el control aglicona-NDI. En segundo lugar, se sintetizaron diferentes derivados glicosilados y alquilados de hidroxitirosol, tirosol y resveratrol. Los derivados de HT y Tyr fueron evaluados como potenciales agentes antiparasitarios mostrando una interesante actividad y selectividad especialmente frente a Trypanosoma brucei. El estudio de la relación estructura-actividad de los compuestos determinó que la longitud óptima de la cadena alifática es de entre 10 y 12 carbonos. Por otro lado, la forma de unión de la cadena alifática al HT parece menos importante, al menos según los resultados obtenidos en el modelo in vitro utilizado. Los derivados alquilados y glicosilados de RES fueron evaluados como potenciales agentes neuroprotectores y anti-inflamatorios. Algunos de estos compuestos demostraron una actividad mejor que el propio RES in vitro. Esta mejora también fue observada en dos modelos in vivo, uno de pez cebra y otro murino. El compuesto 3-O-(6’-O-octanoil)--D-glucopiranosido resveratrol (véase debajo) demostró la mejor actividad neuroprotectora y anti-inflamatoria, señalándolo como un potencial fármaco para enfermedades neurodegenerativas.