Efecto del aumento mutacional sobre el reconocimiento de los motivos estructurales del ARN de la región genómica 5, del virus de la hepatitis C, por factores bioquímicos

Abstract

En la documentación de este trabajo de Tesis Doctoral, han surgido una serie de preguntas como: ¿Cuándo una mutación es funcionalmente neutra o estructuralmente neutral? (Wagner and Stadler 1999) ¿Es posible arrastrar a la extinción un virus, aumentando y acumulando de mutaciones su genoma? (Perales, Agudo et al. 2011) ¿El umbral de tolerancia coincide con la crisis de su eficacia biológica y señala la extinción viral? (Schuster 2011). Si el aumento de la tasa de mutación arrastra a la población a la extinción, porque ocurre: ¿por acumulación de errores en el genoma o por acumulación de mutantes no viables en la población? (Tejero et al., 2010)(Ortega-Prieto, Sheldon et al. 2013) ¿Dónde está el límite de tolerancia a la mutación? (Sheldon, Beach et al. 2014). En su conjunto estas cuestiones nos han llevado a preguntarnos: ¿Qué cantidad de distorsión mutacional es capaz de tolerar un elemento estructural hasta dejar de ser funcional para el genoma ARN de una cuasiespecie viral? Para responder a esta pregunta hemos diseñado una estrategia que nos permita valorar la integridad estructural en el marco poblacional que constituye una cuasiespecie viral. La evaluación de los diferentes elementos y a los distintos niveles estructurales, se ha llevado a cabo a través de la evaluación de las respuestas a sondas bioquímicas y biofísicas, que reconocen y responden (con mayor o menor especificidad) a dichas estructuras. Se ha elegido un modelo de VHC, en el que nuestro grupo ya dispone de una dilatada experiencia y una vasta recopilación de información y resultados. Se ha seleccionado la región VHC1-542, especialmente conservada a nivel de secuencia, rica en motivos y elementos estructurales, y que contiene el elemento IRES con un dominio RDS, responsable del reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S. Todo esto, convierte a nuestro modelo VHC1-542, en un candidato idóneo para estudiar el efecto que ejerce la variabilidad sobre el reconocimiento de sus motivos y elementos estructurales. La variabilidad se ha introducido en la población de secuencias de una forma aleatoria, empleando un método de PCR mutagénica, permitiéndonos generar unas poblaciones del VHC1-542 con ratios de mutaciones y grado de complejidad poblacional crecientes. También se seleccionaron poblaciones del ARN del VHC1-570 extraídas de cultivos celulares transfectados. Se tomaron estas poblaciones a pase 0 y a pase 4, con el fin de poder comparar el efecto de la variabilidad, de la selección natural, producida en los cultivos tras una serie de pases y su efecto sobre los reconocimientos estructurales. Y se tomó también una población tras 4 pases tratados con ribavirina, con la intención de poder evaluar el efecto de la variabilidad inducida por el uso de mutágenos exógenos que arrastran los cultivos a la extinción viral. Finalmente se puso a prueba los efectos de la variabilidad, en cada población, sobre el reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S. Esto nos permite evaluar funcionalmente el conjunto estructural que constituye el IRES del VHC1-542/570 in vivo e in cultivo. Establecida esta estrategia a seguir, se plantearon los Objetivos a perseguir con este trabajo de Tesis Doctoral, a fin de dar respuesta o al menos, aproximarnos en lo posible, a la pregunta que nos planteamos. Las respuestas encontradas en los efectos de la variabilidad pueden representar por si mismas una confirmación de los mecanismos de acción de la mutagénesis letal como estrategia terapéutica frente a virus de ARN como el VHC.