Caracterización de las enzimas esterasas implicadas en la interacción polen-pistilo en el olivo (Olea Europaea L.)

Abstract

El éxito de la fertilización en las Angiospermas depende en gran medida de la capacidad del polen para germinar y emitir un tubo polínico, el cuál transporta los núcleos espermáticos a través del pistilo hasta el saco embrionario. En este contexto, los objetivos de este proyecto fueron: 1) determinar la existencia de actividad esterolítica en el polen de olivo, 2) identificar y clasificar desde el punto de vista funcional las distintas enzimas esterasas, 3) determinar las funciones del exudado estigmático y el 'pollen coat', y 4) caracterizar a nivel bioquímico y molecular la enzima pectina metilesterasa del polen. El polen de olivo contiene al menos 14 enzimas esterasas, agrupadas en tres clases: carboxilesterasas (2), acetilesterasas (6) y colinesterasas (6). Análisis funcionales mediante inhibidores químicos específicos mostraron un efecto adverso sobre la capacidad de germinar del polen y, en el caso del inhibidor DIFP, una disminución significativa de la longitud del tubo polínico. El polen de olivo también posee al menos 12 enzimas esterasa/lipasa capaces de hidrolizar ésteres de cadena larga. Las distintas enzimas presentaron una localización celular específica en el grano de polen y en el tubo polínico. Los datos obtenidos sugieren que las enzimas esterasas del polen están implicadas en la modificación selectiva de la pared celular del tubo polínico, en procesos de comunicación polen-estigma y en la movilización de los lípidos de reserva durante la germinación y el crecimiento del tubo polínico. Además, el perfil electroforético de actividades esterasa del polen varió de forma significativa entre distintos cultivares. Estas diferencias podrían traducirse en variaciones intervarietales en la propia funcionalidad del polen durante la germinación. El análisis comparativo del proteoma de los exudados estigmáticos de olivo y Lilium permitió identificar un total de 576 proteínas, de las cuales 290 están presentes en el olivo y 286 en Lilium. Por otro lado, en el 'pollen coat' de olivo se identificaron 162 proteínas. Entre las proteínas identificadas, destacan diversas enzimas esterasas implicadas en la modificación selectiva de los componentes polisacarídicos de la pared del tubo polínico y en el catabolismo de los lípidos de reserva del polen. En términos generales, la composición del proteoma varía significativamente entre ambas especies. Este hecho parece reflejar profundas divergencias a nivel funcional, que en su mayor parte se podrían explicar por las propias características morfológicas y ecológicas de cada especie. Los datos obtenidos sugieren que el exudado estigmático es un sitio metabólicamente activo, y que participa directamente en la comunicación con el polen, la regulación del crecimiento del tubo polínico, y su adhesión y orientación en el estigma. La mayoría de las proteínas del exudado son secretadas a través del aparato de Golgi. Sin embargo, algunas de las proteínas identificadas no presentan un péptido señal, y podrían ser secretadas a través de la membrana plasmática mediante un mecanismo exocítico alternativo no regulado. Finalmente, se clonó y caracterizó una enzima pectina metilesterasa (PME) de tipo I de 40 kDa en el polen de olivo, que se expresa durante su ontogenia y durante la germinación. En el polen, la actividad PME se localizó en vesículas presentes en el citoplasma de la célula vegetativa, así como en las aperturas del grano y la pared celular de la célula generativa. Este patrón de distribución de la actividad enzimática coincide con la localización subcelular de la proteína. Durante la germinación, la enzima se localizó principalmente en la capa pectocelulósica de la pared del tubo polínico y en el medio extracelular, donde es muy activa. La actividad PME se detectó en el citoplasma de las papilas y en el exudado estigmático. El patrón de expresión del gen y la proteína es idéntico lo que sugiere que la expresión de dicha proteína está probablemente regulada a nivel transcripcional. Esta enzima estaría implicada, a través de la degradación controlada de los compuestos pécticos, en la separación de las microsporas de la tétrada en la antera, y en la consolidación de la pared celular primaria del tubo polínico durante la germinación.