Expanding chemical diversity in fungi and evaluation of its application for discovering new antifungal agents

Abstract

Los hongos fitopatógenos son la principal causa de pérdidas en el sector agrícola, responsables de graves daños ecológicos y económicos. A pesar de que el uso de agroquímicos es el método preferido para el control de estos patógenos de plantas, presentan desafíos medioambientales. Por ello, se necesitan nuevas alternativas para controlar su infección en plantas con bajo riesgo para el medio ambiente y la salud humana. Hoy en día, el uso de cepas microbianas y su actividad antagónica presentan ventajas para el biocontrol de fitopatógenos. Los hongos se consideran una de las fuentes más prolíficas de Productos Naturales, con una amplia diversidad estructural y biológica. Sin embargo, la mayor parte de su potencial biosintético permanece inactivo en condiciones estándares de laboratorio, lo que requiere aplicar aproximaciones basadas en técnicas de cultivo efectivas para explorar su diversidad química única. Este estudio evaluó diferentes métodos innovadores para inducir la producción de metabolitos secundarios bioactivos en una amplia diversidad de hongos, y la evaluación de su potencial como fungicidas frente a cuatro hongos fitopatógenos relevantes. Las interacciones microbianas juegan un papel crucial en su entorno natural a través de la producción de metabolitos/señales. Estas interacciones naturales pueden ser imitadas artificialmente mediante técnicas de co-cultivo. Inicialmente, se co-cultivaron 762 cepas aisladas de numerosos orígenes geográficos frente al hongo fitopatógeno Botrytis cinerea, resultando en 93 antagonismos positivos (12% de tasa de éxito). Las zonas de inhibición y micelio inhibido del fitopatógeno fueron extraídas para identificar los metabolitos responsables de los antagonismos. Los análisis de espectrometría de masas revelaron una clara comunicación bidireccional entre ambas cepas co-cultivadas, y más interesante aún, las interacciones fúngicas con B. cinerea indujeron la activación de rutas silenciosas para la biosíntesis de nuevos metabolitos. Se exploró una segunda metodología para maximizar la producción de nuevos compuestos bioactivos, involucrando condiciones nutricionales específicas combinado con el modificador epigenético SAHA, en una nueva selección de cepas fúngicas aisladas de muestras de hojarascas recolectadas en Sudáfrica. Estudios de metabolómica no dirigida mostraron que las variaciones en la composición del medio indujeron importantes cambios en los perfiles metabolómicos, siendo determinante para la producción de metabolitos únicos, donde la fermentación en estado sólido en el medio BRFT fue la condición más productiva. Además, la adición de SAHA aumentó significativamente la diversidad y la cantidad de metabolitos en todos los medios de fermentación. Métodos avanzados de cribado de alto rendimiento (HTS) permitieron desarrollar una plataforma efectiva y robusta para identificar nuevos agentes antifúngicos frente a Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Fusarium proliferatum y Magnaporthe grisea. Esta plataforma HTS fue validada para una amplia variedad de muestras, desde compuestos sintéticos hasta mezclas naturales complejas. El método HTS por microdilución mostró mayor eficiencia para evaluar el potencial antifúngico, el cual fue aplicado para caracterizar la diversidad química inducida en hongos asociados a hojarasca. El cribado primario reveló un alto número de extractos activos (n=340, 14% tasa de éxito), explicado por una amplia variedad de compuestos bioactivos conocidos. Además, el SAHA mejoró la diversidad química general y, en consecuencia, las tasas de acierto de actividad antifúngica, permitiendo identificar metabolitos poco expresados como la nueva molécula libertamide, producida por la cepa Libertasomyces aloeticus CF-168990, que resultó ser un posible nuevo biofungicida para la mancha foliar de septoria causada por Zymoseptoria tritici. En resumen, este estudio ha integrado diferentes enfoques basados en el cultivo de una amplia diversidad de cepas fúngicas, con el objetivo de explorar su potencial biosintético silente para producir metabolitos bioactivos. Además, la implementación de métodos analíticos avanzados, tanto en la caracterización química como en la actividad biológica, facilitó el descubrimiento de posibles nuevos fungicidas para el biocontrol de hongos fitopatógenos relevantes.

Fungal phytopathogens are the major cause of agricultural losses, responsible for severe ecological and economic damage. Despite agrochemical agents are the preferred method to control these plant pathogens, they present environmental challenges. Therefore, new alternatives are needed to control plant diseases with low risk to the environment and human health. Nowadays, the use of microbial strains and their antagonistic activities present advantages for the biocontrol of phytopathogens. Fungi are considered one of the most prolific sources of Natural Products with a broad structural and biological diversity. However, most of their biosynthetic potential remain inactive under standard laboratory conditions, which requires effective cultured-based approaches to explore their unique chemical diversity. This study assessed different innovative methods to induce the production of bioactive secondary metabolites in a broad diversity of fungal strains, as well as the evaluation of their potential as fungicides against four relevant phytopathogens. Microbial interactions play a crucial role within their natural environment through the production of metabolites/signals. These natural interactions can be artificially mimicked by co-culturing techniques. Initially, 762 strains isolated from numerous geographical origins were co-cultured with the fungal phytopathogen Botrytis cinerea, resulting in 93 positive antagonisms (12% hit-rate). The inhibition zones and inhibited mycelia of the phytopathogen were extracted to identify the metabolites responsible for the antagonisms. Mass spectrometry analyses revealed a clear bidirectional communication between both co-cultured strains, and more interestingly, fungal interactions with B. cinerea induced the activation of silent pathways for the biosynthesis of new metabolites. A second methodology was explored to maximize the production of novel bioactive compounds, involving specific nutritional arrays combined with the epigenetic elicitor SAHA, on a new selection of fungal strains isolated from leaf-litter collected in South Africa. Untargeted metabolomics showed that variations in the medium composition induced important changes in the metabolomic profiles, determining the production of unique metabolites, being the solid-state fermentation in the medium BRFT the most productive condition. Moreover, the addition of SAHA significantly increased the diversity and amounts of metabolites in all fermentation media. Advanced high-throughput screening (HTS) methods allowed to develop an effective and robust platform to identify new antifungal agents against Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Fusarium proliferatum and Magnaporthe grisea. The HTS Platform has been validated for a wide range of samples from synthetic compounds to complex natural mixtures. This HTS microdilution method showed greater efficiency to assess the antifungal potential, that was applied to characterize the chemical diversity induced in leaf-litter-associated fungi. The primary screening revealed a high number of active extracts (n=340, 14% hit-rate), what was explained by a broad variety of known bioactive compounds. Moreover, SAHA enhanced the general chemical diversity, and consequently the antifungal activity hit-rates, allowing the identification of poorly expressed metabolites such as the novel molecule libertamide, produced by the strain Libertasomyces aloeticus CF-168990, a potential new bio-fungicide for septoria leave blotch caused by Zymoseptoria tritici. In summary, this study has integrated different culture-based approached on a wide diversity of fungal strains to successfully explore their cryptic biosynthetic potential to produce bioactive metabolites. Furthermore, the implementation of advances analytical methods, both in chemical and biological activity characterization, has facilitated the discovery of possible new fungicides for the biocontrol of relevant phytopathogens.