Evaluación biológica en cultivos celulares y modelos animales del transporte dirigido de fármacos mediado por nuevos vectores antitumorales basados en ciclodextrinas Plesselova, Simona Girón González, María Dolores Salto González, Rafael Universidad de Granada. Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular Transporte dirigido de fármacos Tumores Ciclodextrinas Targeted drug transport Tumors Cyclodextrins Esta Memoria ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II de la Universidad de Granada con la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario (FPU 15/034701) de Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Los gastos experimentales derivados de la misma han sido sufragados por los proyectos de investigación CTQ2014-55474-C2-2-R y CTQ2017-86125-P de Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. En la presente tesis, hemos realizado la evaluación biológica de diversos agentes teragnósticos específicos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores que actualmente presentan un mal pronóstico y problemas de resistencias y recurrencias como son el cáncer de mama triple negativo, el osteosarcoma o el cáncer de cérvix uterino. (10–12) Para ello, se han ensayado los agentes teragnósticos PEI-NIR-780, que permiten simultáneamente el diagnóstico específico gracias a la sonda NIR-780 que fluoresce en el infrarrojo cercano (NIR, near infrared) y la terapia génica gracias a la polietilenimina (PEI) que permite establecer fuerzas electrostáticas con el material genético a través de sus aminas secundarias y terciarias. (13,14) La fluorescencia en el infrarrojo cercano permite el diagnóstico del cáncer en estadíos tempranos debido a su alta sensibilidad, permitiendo la posibilidad de diagnóstico in vivo y evitando la autofluorescencia de los tejidos. Las sondas NIR-780 presentan además la capacidad de transporte dirigido específicamente hacia las células tumorales. (15,16) En la presente tesis, hemos demostrado que estas nanopartículas tienen una buena capacidad de unión al DNA, protección de la degradación de las DNAsas, una baja citotoxicidad y una buena eficiencia de transfección. Además, permiten su funcionalización con b-ciclodextrinas para la inclusión de agentes quimioterapéuticos poco solubles como es la doxorubicina para aumentar su solubilidad, permitiendo su liberación controlada y favoreciendo su transporte dirigido hacia las células tumorales. (17,18) Asimismo, las aminas secundarias y terciarias de PEI han permitido su funcionalización con moléculas directoras como bifosfonatos o ácido hialurónico para su transporte dirigido y específico hacia sus dianas moleculares sobreexpresadas en los tejidos tumorales. Las nanopartículas de PEI recubiertas con bifosfonatos (PEI-BP) han demostrado su capacidad de transporte dirigido específico de la doxorubicina hacia los osteosarcomas y las metástasis óseas causadas por el cáncer de mama triple negativo, debido a su afinidad por el hidroxiapatito, el principal constituyente del tejido óseo, y de los agentes de diagnóstico como es la indocianina green en los modelos animales con xenografts de ambos tipos de cáncer. Además, estas nanopartículas pueden dirigir el agente terapéutico hacia las mitocondrias, como un mecanismo alternativo de citotoxicidad en las células tumorales resistentes al tratamiento. (19) Por otra parte, las nanopartículas PEI-NIR-780 recubiertas con el ácido hialurónico (HA) de 40-50 kDa han demostrado la capacidad de diagnóstico específico y transporte dirigido de la doxorubicina y del material genético tanto en los cultivos celulares como en los modelos animales de cáncer de mama triple negativo, que sobreexpresa los receptores CD44 específicos para HA. (20) Asimismo, hemos demostrado que estas nanopartículas son versátiles y permiten actuar como agentes teragnósticos también en otros tipos de cáncer CD44+, como es el cáncer cervical y, además, son capaces de evitar la cardiotoxicidad asociada al uso de la doxorubicina. Por tanto, hemos demostrado que nuestros agentes teragnósticos son nanosistemas multifuncionales que permiten el tratamiento y el diagnóstico específicos y selectivos del cáncer, al dirigir específicamente y de forma eficiente el agente terapéutico (material genético y/o fármaco quimioterapéutico) al tejido tumoral sin afectar los tejidos sanos y permitiendo una monitorización del proceso en tiempo real. Además, a pesar de que existen diferentes sub-tipos de cáncer de mama, en la práctica clínica se administra un tratamiento estándar en todas las pacientes (21) y se ha demostrado que las interacciones de las células tumorales con el microambiente tumoral interfieren en la eficacia terapéutica y en las resistencias al tratamiento. (22) Por tanto, hemos realizado un cribado de siete fármacos quimioterapéuticos comúnmente utilizados en la terapia clínica en cinco sub-tipos de células de cáncer de mama cultivadas en el modelo tridimensional de plasma humano (HuP3D) y hemos demostrado que el microambiente tumoral interfiere en la respuesta terapéutica originando una gran heterogeneidad y la necesidad de utilizar distintos parámetros para la evaluación de la eficacia terapéutica de los fármacos. Asimismo, se ha observado que las nanopartículas PEI-NIR-780 recubiertas con el ácido hialurónico permiten un transporte dirigido y diagnóstico específicos en las células de cáncer de mama triple negativo cultivadas en HuP3D. Por último, hemos ensayado nuevos agentes de diagnóstico basados en las sondas fluorescentes NIR-783 y en las nanopartículas fluorescentes Carbon Dots conjugadas con los carbohidratos manosa, lactosa, N-acetilglucosamina y glucosa y hemos demostrado su baja citotoxicidad y su especificidad hacia las células tumorales que sobre-expresan los receptores GLUT1, galectina-3 y asialoglicoproteínas. In this thesis, we have carried out the biological evaluation of various specific theragnostic reagents for the diagnosis and treatment of tumors that currently have a poor prognosis and high resistance and recurrence levels, such as triple-negative breast cancer, osteosarcoma, and cervical cancer. (10–12) For this purpose, the PEI-NIR-780 theragnostic agents have been tested, which simultaneously allow specific diagnosis thanks to the NIR-780 probe that fluoresces in the near-infrared spectrum and gene therapy thanks to polyethyleneimine (PEI) that can establish electrostatic forces with genetic material through its secondary and tertiary amines. (13,14) The near-infrared fluorescence allows the cancer diagnosis in the early stages due to its high sensitivity, allowing the possibility of in vivo diagnosis and avoiding the tissue autofluorescence. Also, the NIR-780 probe can target specifically to tumor cells. (15,16) In the present thesis, we have shown that these nanoparticles have good DNA binding capacity, protection from DNAse degradation, low cytotoxicity, and good transfection efficiency. Also, they allow its functionalization with b-cyclodextrins for the inclusion of poorly soluble chemotherapeutic drugs such as doxorubicin to increase its solubility, allowing its controlled release and targeting towards tumor cells. (17,18) Likewise, the secondary and tertiary amines of PEI have allowed their functionalization with bioligands such as bisphosphonates or hyaluronic acid for their targeted and specific transport to their molecular targets overexpressed in tumor tissues. The nanoparticles coated with bisphosphonates (PEI-BP) have demonstrated specific targeting of doxorubicin towards osteosarcomas and bone metastases caused by triple-negative breast cancer, due to their affinity for hydroxyapatite, the main constituent of bone tissue, and specific transport of diagnostic agents such as indocyanine green in animal models with xenografts of both cancer types. Besides, these nanoparticles can direct the therapeutic agents towards the mitochondria, as an alternative mechanism of cytotoxicity in tumor cells resistant to treatment. (19) On the other hand, PEI-NIR-780 nanoparticles coated with hyaluronic acid (HA) of 40-50 kDa have demonstrated the capacity for specific diagnosis and targeted transport of doxorubicin and genetic material in cell cultures and animal models of triple-negative breast cancer, over-expressing HA-specific CD44 receptors. (20) Furthermore, we have shown that these nanoparticles are versatile and can act as theragnostic reagents also in other types of CD44 + cancer, such as cervical cancer, and, also, they can avoid the cardiotoxicity associated with the use of doxorubicin. Therefore, we have shown that our theragnostic agents are multifunctional nanosystems that allow the specific and selective cancer treatment and diagnosis by specifically and efficiently targeting the therapeutic agent (genetic material and/or chemotherapeutic drug) to tumor tissue without affecting healthy cells and allow realtime monitorization. In addition, a standard clinical treatment is used in all breast cancer patients even though different molecular sub-types can be resistant to the treatment. (21) Also, it has been shown that the interactions of tumor cells with the tumor microenvironment interfere with the therapeutic efficacy and can cause drug resistance. (22) Therefore, we have screened seven chemotherapeutic drugs commonly used in clinical therapy in five breast cancer cells sub-types cultured in the three-dimensional model of human plasma (HuP3D) and we have shown that the tumor microenvironment interferes in the therapeutic response, causing great heterogeneity and the need to use different parameters for the evaluation of the drug efficacy. Likewise, it has been observed that PEI-NIR-780 nanoparticles coated with hyaluronic acid allow specific targeting and diagnosis in triple-negative breast cancer cells cultured in HuP3D. Finally, we have tested new diagnostic agents based on the fluorescent NIR-783 probes and the fluorescent Carbon Dots nanoparticles conjugated with the carbohydrates such as mannose, lactose, glucose, and N-acetylglucosamine and we have demonstrated their low cytotoxicity and their specificity towards tumor cells that overexpress the GLUT-1, galectin-3, and asialoglycoproteins receptors. 2021-05-20T06:22:13Z 2021-05-20T06:22:13Z 2021 2021-05-07 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis Plesselova, Simona. Evaluación biológica en cultivos celulares y modelos animales del transporte dirigido de fármacos mediado por nuevos vectores antitumorales basados en ciclodextrinas. Granada: Universidad de Granada, 2021. [http://hdl.handle.net/10481/68573] 9788413068763 http://hdl.handle.net/10481/68573 spa http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/ info:eu-repo/semantics/openAccess Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 España Universidad de Granada