Benzoxazine–Purine Hybrids as Antiproliferative Agents: Rational Design and Divergent Mechanisms of Action Boulaiz Tassi, Houria Jiménez-Martínez, Yaiza Franco Montalbán, Francisco Peña-Martín, Jesús Conejo García, Ana Carrión Peregrina, María Dora Background/Objectives: Targeted cancer therapies increasingly rely on modulating specific cell death pathways and kinase signaling. Due to their structural versatility and potential to induce mechanistically distinct cytotoxic responses, benzoxazine–purine hybrids represent a promising scaffold for anticancer drug development. The objective of this study was to design and evaluate novel benzoxazine–purine derivatives for their antiproliferative activity and elucidate their underlying mechanisms of action. Methods: A series of benzoxazine–purine compounds was synthesized via a modular and efficient approach. The synthetic route involved a one-pot cyclization of substituted 2-aminophenols with epichlorohydrin, followed by tosylation and subsequent Mitsunobu coupling with halogenated purines. Their antiproliferative activity was assessed in MCF-7 (breast) and HCT-116 (colon) cancer cell lines using MTT assays. Selected compounds were evaluated further for kinase inhibition, effects on the cell cycle, membrane integrity (Annexin V/PI staining), ultrastructural changes (SEM), and caspase activation (Western blot). In silico ADMET profiling was also performed. Results: Compounds 9 and 12 exhibited the most potent antiproliferative activity, with low micromolar IC50 values. Compound 12 showed dual HER2/JNK1 kinase inhibition and induced caspase-8-dependent pyroptosis-like cell death, characterized by membrane rupture and inflammatory features. In contrast, compound 8 lacked kinase inhibition and promoted S-phase arrest with apoptotic-like morphology. Both compounds demonstrated favorable physicochemical and ADMET profiles, including high intestinal absorption and an absence of mutagenicity. Conclusions: The rational design of benzoxazine–purine hybrids resulted in the discovery of compounds with distinct mechanisms of action. Compound 12 induces inflammatory cell death by modulating kinases, while compound 9 acts through a kinase-independent apoptotic pathway. These results underscore the therapeutic potential of scaffold-based diversification for developing targeted anticancer agents. Resumen Antecedentes/Objetivos: Las terapias oncológicas dirigidas dependen cada vez más de la modulación de vías específicas de muerte celular y de la señalización de quinasas. Debido a su versatilidad estructural y su potencial para inducir respuestas citotóxicas mecánicamente distintas, los híbridos benzoxazina–purina representan una estructura prometedora para el desarrollo de fármacos anticancerígenos. El objetivo de este estudio fue diseñar y evaluar nuevos derivados benzoxazina–purina analizando su actividad antiproliferativa y sus mecanismos de acción. Métodos: Se sintetizaron una serie de derivados de benzoxazina–purina mediante un enfoque modular y eficiente. La ruta sintética incluyó una ciclación en un solo paso de 2-aminofenoles sustituidos con epiclorhidrina, seguida de tosilación y acoplamiento de Mitsunobu con purinas halogenadas. La actividad antiproliferativa se evaluó en líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7) y colon (HCT-116) mediante ensayos MTT. Algunos compuestos seleccionados se analizaron más a fondo para determinar la inhibición de quinasas, efectos sobre el ciclo celular, integridad de membrana (tinción Annexin V/PI), cambios ultraestructurales (microscopía electrónica de barrido) y activación de caspasas (Western blot). También se realizó un perfil ADMET in silico. Resultados: Los compuestos 9 y 12 mostraron la actividad antiproliferativa más potente, con valores de IC50 en el rango micromolar. El compuesto 12 presentó inhibición dual de las quinasas HER2/JNK1 e indujo una muerte celular tipo piroptosis dependiente de caspasa-8, caracterizada por ruptura de membrana y características inflamatorias. En contraste, el compuesto 8 no mostró inhibición de quinasas y promovió una detención de ciclo celular en fase S con morfología apoptótica. Ambos compuestos demostraron perfiles fisicoquímicos y ADMET favorables, incluyendo alta absorción intestinal y ausencia de mutagenicidad. Conclusiones: El diseño racional de híbridos de benzoxazina–purina permitió descubrir compuestos con mecanismos de acción divergentes. El compuesto 12 induce muerte celular inflamatoria mediante la modulación de quinasas, mientras que el compuesto 9 actúa a través de una vía apoptótica independiente de quinasas. Estos resultados destacan el potencial terapéutico de la diversificación estructural para el desarrollo de nuevos agentes anticancerígenos. 2025-10-01T07:37:33Z 2025-10-01T07:37:33Z 2025-09-26 journal article Boulaiz, H.; Jiménez-Martínez, Y.; Franco-Montalbán, F.; Peña-Martín, J.; Conejo-García, A.; Carrión, M. D. Benzoxazine–purine hybrids as antiproliferative agents: Rational design and divergent mechanisms of action. Pharmaceutics, 2025, 17(10), 1260. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics17101260 https://hdl.handle.net/10481/106735 10.3390/pharmaceutics17101260 eng http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ open access Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional MDPI