The role of Ly108 isoforms in lymphocyte activation

Abstract

El Ly108 es una molécula homófila que se expresa en la membrana plasmática, pertenece a las moléculas de la familia del SLAM, e igual que muchas de éstas se asocia a SAP (proteína asociada a SLAM), una proteína adaptadora intracelular que modula las respuestas inmunitarias humorales. El Ly108 se viene describiendo como crucial para el desarrollo de células invariantes NKT y la citotoxicidad de los linfocitos T citotóxicos. Se ha prestado especial atención a la expresión y función de Ly108 desde que se identificaron múltiples isoformas, algunas de las cuales se expresan de forma diferencial en distintas cepas de ratón. En esta tesis estudiamos la expresión y la función de Ly108 usando anticuerpos monoclonales y una proteína de fusión de Ly108, ambos generados por nosotros. Además, con éstos muestro un estudio destallado de los perfiles de expresión en la mayoría de los principales subconjuntos de células inmunitarias. También encuentro efectos coestimuladores o coinhibidores sobre la función de las células T a través de Ly108 dependiendo del reactivo utilizado y del modo de administración. A continuación, se compara la función de las isoformas individuales. Anteriormente habíamos demostrado que la isoforma Ly108-H1 que descubrí podía proteger contra la enfermedad en un modelo de ratón congénito de Lupus. En el trabajo que presento aquí, utilizo líneas celulares para definir aún más la función de Ly108-H1 en comparación con otras isoformas. Demuestro que Ly108-H1 inhibe la producción de IL-2, mientras que tiene poco efecto sobre la muerte celular. Con un método refinado, muestro que se detecta la fosforilación de Ly108-H1 y que éste se mantiene unido a SAP. Finalmente, propongo que Ly108-H1 puede regular la señalización a dos niveles al retener la capacidad de unirse a sus ligandos extracelulares (otras moléculas Ly108) así como a ligandos intracelulares como SAP, e inhibiendo posiblemente las vías descendentes. Además, muestro la detección de Ly108-3 en células primarias que esta isoforma también se expresa de forma diferencial entre cepas de ratón. La presencia de motivos de unión adicionales y de un SNP no sinónimo en Ly108-3 amplía aún más la diversidad entre cepas murinas. En conjunto este trabajo subraya la importancia de conocer las isoformas, ya que la homología inherente puede suponer un reto a la hora de interpretar los datos de expresión de ARNm y proteínas, especialmente porque la expresión alternativa de ARNm o splicing afecta potencialmente a la función de la proteína.

Ly108 is a homophilic cell surface molecule that binds SLAM-associated protein (SAP), an intracellular adapter protein that modulates humoral immune responses. Furthermore, Ly108 is crucial for the development of invariant natural killer T (iNKT) cells and CTL cytotoxicity. Significant attention has been paid towards expression and function of Ly108 since multiple isoforms were identified, some of which are differentially expressed in mouse strains. We generated monoclonal antibodies and a Ly108 fusion protein to study expression and function of Ly108. I show detailed expression profiles on most major immune cell subsets. I also found co-stimulatory or co-inhibitory effects on T cell function that is dependent on the reagent used and the mode of delivery. I went on to compare the function of individual isoforms. We have previously shown that the Ly108-H1 that I previously discovered could protect against disease in a congenic mouse model of Lupus. Here, I use cell lines to further define Ly108-H1 function in comparison with other isoforms. I show that Ly108- H1 inhibits IL-2 production while having little effect upon cell death. With a refined method, I could detect phosphorylation of Ly108-H1 and show that SAP binding is retained. I propose that Ly108-H1 may regulate signaling at two levels by retaining the capability to bind its extracellular ligands (other Ly108 molecules) as well as intracellular ligands such as SAP, thereby possibly inhibiting downstream pathways. In addition, I detected Ly108-3 in primary cells and show that this isoform is also differentially expressed between mouse strains. The presence of additional binding motifs and a non-synonymous SNP in Ly108-3 further extends the diversity between murine strains. This work highlights the importance of isoform awareness, as inherent homology can present a challenge when interpreting mRNA and protein expression data, especially since alternatively splicing potentially affects protein function.