Desarrollo de nutracéuticos a partir de semillas para el tratamiento de la obesidad y alteraciones relacionadas a nivel hepático. Efecto combinado de un protocolo de entrenamiento interválico de alta intensidad

Abstract

La obesidad y el sobrepeso se definen como una acumulación anormal o excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud. Esta patología, además, es uno de los principales factores de riesgo para la resistencia a la insulina o la diabetes tipo II, la enfermedad de hígado graso no alcohólico, las enfermedades cardiovasculares, la hipertensión, los accidentes cerebrovasculares y varios tipos de cáncer. The World Obesity Federation indicó que para el año 2035, se estima que el 54 % de la población adulta mundial presente alguna de estas patologías. La obesidad es debida fundamentalmente a un desequilibrio entre la ingesta de calorías y el gasto energético. El exceso de energía, que normalmente proviene del aumento del consumo de grasas saturadas y azúcares refinados, se almacenará en forma de triglicéridos en el interior de los adipocitos, favoreciendo la síntesis de nuevos ácidos grasos (lipogénesis de novo) y disminuyendo la capacidad de la β-oxidación de los ácidos grasos. Además, esta patología favorece el desarrollo de resistencia a la insulina, que afecta negativamente a la captación, el metabolismo o el almacenamiento de glucosa por parte de los tejidos diana como el músculo esquelético, el hígado y el tejido adiposo. Todas estas alteraciones generan diferentes complicaciones en el organismo como son la inflamación, lipotoxicidad, disfunción mitocondrial y estrés oxidativo, entre otras. Otro aspecto importante sobre el efecto deletéreo del desarrollo de la obesidad, y que ha cobrado gran importancia en la actualidad, es que los ambientes obesogénicos promueven una alteración de la microbiota intestinal, produciendo lo que se conoce como disbiosis. En general en individuos obesos, se ha comprobado que existe un aumento de la proporción Firmicutes/Bacteroidota que provoca un mayor aprovechamiento de la energía calórica a partir de la fermentación de glúcidos dietéticos, los cuales pueden ser utilizados para la lipogénesis hepática. Actualmente, los principales tratamientos para la obesidad están centrados en intervenciones que contribuyan a disminuir el aporte o a aumentar el gasto energético. Entre estas estrategias, las más recomendadas son la restricción de la ingesta dietética o la realización de ejercicio físico. Además, se deben modificar tanto la calidad como la naturaleza de los alimentos. En este sentido, es recomendable combinar la ingesta de compuestos bioactivos que puedan potenciar los efectos metabólicos asociados a la pérdida de peso. Estos componentes bioactivos pueden obtenerse a partir de la elaboración de extractos funcionales procedentes de vegetales, que puedan administrarse como nutracéuticos. Resulta de especial interés, la obtención de estos compuestos bioactivos a partir de residuos de la industria agroalimentaria como podrían ser las semillas que han perdido su capacidad de germinación, y que terminan siendo tratadas como un residuo. Esto proporcionaría valor añadido a estos nutracéuticos, ya que contribuirían a la sostenibilidad medioambiental a través del concepto de economía circular. En algunas ocasiones es necesaria la utilización de tratamientos farmacológicos. Entre ellos, en la última década, los agonistas del receptor del péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), como la semaglutida, han centrado la atención de la industria farmacéutica por su acción antidiabética y frente a la obesidad. Por todo lo comentado anteriormente, el objetivo general de esta tesis doctoral fue contribuir a la prevención y manejo de patologías crónicas relacionadas con la obesidad derivadas de hábitos alimentarios y de estilo de vida poco saludables a través de diferentes intervenciones individuales o combinadas (nutracéutico derivado de semillas y ejercicio físico vs tratamiento farmacológico) y promover estrategias de sostenibilidad ambiental. Para ello, el trabajo de esta tesis doctoral se dividió en dos fases: 1) con el objetivo de desarrollar en ratas Sprague-Dawley el modelo experimental de obesidad inducido por la dieta idóneo para el estudio de las alteraciones asociadas como la enfermedad hepática no alcohólica, la resistencia a la insulina y disbiosis intestinal; y 2) con el objetivo de ensayar el efecto de diferentes intervenciones (sobre una aplicación de restricción calórica): nutracéutico desarrollado a partir de semillas, protocolo de entrenamiento interválico de alta intensidad y fármaco agonista del receptor de GLP-1, en las alteraciones inducidas por la obesidad. Además, se estudió el efecto combinado del protocolo de entrenamiento con la administración del nutracéutico o la administración del fármaco agonista del receptor de GLP-1. En esta primera fase, para el desarrollo idóneo del modelo experimental animal de obesidad inducido por dieta, se suministró una dieta alta en grasa y fructosa en el agua de bebida a medio (13 semanas) y largo plazo (21 semanas). Como cabría esperar, el consumo de esta dieta obesogénica produjo un incremento del peso corporal, así como, las esperadas alteraciones asociadas de esteatosis hepática, estrés oxidativo, resistencia a la insulina y disbiosis intestinal. La diferente duración del periodo experimental nos mostró que los mecanismos de acúmulo de grasa hepática fueron distintos: mediante la lipogénesis de novo a medio plazo, o la alteración del catabolismo de ácidos grasos por β-oxidación, a largo plazo. Para conseguir los objetivos de la segunda fase de trabajo, se realizó un screening sobre 25 semillas vegetales, un residuo de la industria agroalimentaria como la pulpa del Argania spinosa y las hojas de Salicornia spp. mediante la preparación de extractos funcionales (extractos etanólicos y/o hidrolizados proteicos) con el objetivo de seleccionar aquellos que mostrasen una mayor capacidad antioxidante y rendimiento de extracción para la formulación y el desarrollo de un nutracéutico. Este nutracéutico, fue sometido a un proceso de digestibilidad in vitro, y se evaluó su capacidad antioxidante tanto mediante pruebas químicas, como en las líneas celulares HT-29 y HepG2. Además, se evaluó su capacidad para disminuir la acumulación de triglicéridos y la lipotoxicidad en la línea celular AML12. Finalmente, se identificaron de forma tentativa, los compuestos y péptidos bioactivos presentes en el nutraceútico mediante UPLC y HPLC, respectivamente. En segundo lugar y en base a los resultados obtenidos en la fase anterior, para el ensayo in vivo, se seleccionó un periodo experimental de 16 semanas de duración: 8 semanas de inducción de la obesidad y 8 semanas de tratamiento con la administración del nutracéutico, la realización del protocolo de entrenamiento y la inyección del fármaco semaglutida. Los principales resultados de esta fase mostraron una alta capacidad antioxidante de los extractos funcionales preparados, y un alto rendimiento de extracción que condicionó la selección de extractos para la formulación y desarrollo del nutracéutico. Este nutraceútico mostró un amplio perfil de compuestos bioactivos que le confirieron un potente efecto antioxidante y antiesteatótico. Además, el nutraceútico no mostró toxicidad celular y el proceso de digestión in vitro realizado confirmó su alta bioaccesibilidad. La administración del nutracéutico en el modelo experimental animal de obesidad desarrollado mostró una disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes hepáticas, lo que corroboró su potente efecto antioxidante encontrado en los ensayos in vitro. Además, su consumo produjo una reducción en la resistencia a la insulina, disminuyendo el área bajo la curva tras la realización de una prueba de sobrecarga oral a la glucosa, (con mayor eficacia incluso que la administración del fármaco semaglutida). Los efectos beneficiosos del nutracéutico también se vieron reflejados por su efecto antiinflamatorio, la aminoración del desequilibrio en el metabolismo lipídico y por su marcado efecto prebiótico al disminuir la proporción Firmicutes/Bacteroidota. En cuanto a la administración del fármaco semaglutida, éste promovió la reducción de la esteatosis hepática, pero mostró efectos secundarios ya que tuvo una acción hipercolesterolemiante, así como, prooxidante en hígado, y proinflamatorio en tejido adiposo y, especialmente, en el colon, donde contribuyó a la disbiosis intestinal. Por último, el protocolo de ejercicio físico contribuyó de manera eficaz no sólo en la pérdida de peso corporal, sino también en la grasa hepática a través de la activación de las rutas lipolíticas. La combinación de la práctica de ejercicio físico con la administración del nutracéutico y la semaglutida, mejoraron la funcionalidad cardiopulmonar ya que mejoraron la capacidad aeróbica de los animales; además el protocolo de entrenamiento contrarrestó los efectos negativos que la administración del fármaco promovió sobre el estrés oxidativo a nivel del tejido hepático. Finalmente, y a modo de conclusión, podemos decir que todas las intervenciones ensayadas fueron beneficiosas para el tratamiento de la obesidad inducida por la dieta a través de la pérdida de peso corporal o mayoritariamente a través de los efectos encontrados a nivel metabólico. A la dosis ensayada, el nutracéutico podría ser una importante herramienta terapéutica produciendo efectos beneficiosos a distintos niveles en el organismo y contribuyendo a recuperar la salud. Este efecto se vería potenciado por la práctica de ejercicio físico.

Obesity and overweight are defined as an abnormal or excessive accumulation of fat that can be detrimental to health. It is also a major risk factor for insulin resistance or type II diabetes, non-alcoholic fatty liver disease, cardiovascular diseases, hypertension, stroke and several types of cancer. The World Obesity Federation estimated that 54 % of the world's adult population by 2035 will have one or more of these conditions. Obesity is mainly due to an imbalance between calorie intake and energy expenditure. Excess energy, which normally comes from increased consumption of saturated fats and refined sugars, will be stored in the form of triglycerides inside adipocytes, favouring the synthesis of new fatty acids (de novo lipogenesis) and decreasing the capacity for β-oxidation of fatty acids. In addition, this pathology favours the development of insulin resistance, which negatively affects the uptake, metabolism or storage of glucose by target tissues such as skeletal muscle, liver and adipose tissue. All these alterations lead to various complications in the body such as inflammation, lipotoxicity, mitochondrial dysfunction and oxidative stress, among others. Another important aspect of the deleterious effect of the development of obesity, which has gained great importance nowadays, is that obesogenic environments promote an alteration of the intestinal microbiota, producing what is known as dysbiosis. In general, in obese individuals, it has been shown that there is an increase in the Firmicutes/Bacteroidota ratio that leads to a greater use of caloric energy from the fermentation of dietary carbohydrates, which can be used for hepatic lipogenesis. Currently, the main treatments for obesity are focused on interventions that contribute to decreasing energy intake or increasing energy expenditure. Among these strategies, the most recommended are restriction of dietary intake or physical exercise. In addition, both the quality and the nature of food should be modified. In this regard, it is recommendable to combine the intake of bioactive compounds that can enhance the metabolic effects associated with weight loss. These bioactive compounds can be obtained from the production of functional plant extracts that can be administered as nutraceuticals. It is of particular interest to obtain these bioactive compounds from waste from the agri-food industry, such as seeds that have lost their germination capacity and end up being treated as waste. This would provide added value to these nutraceuticals, as they would contribute to environmental sustainability through the concept of circular economy. The use of pharmacological treatments is sometimes necessary. Among them, in the last decade, glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonists, such as semaglutide, have focused the attention of the pharmaceutical industry for their anti-diabetic and anti-obesity action. In view of the above, the main objective of this doctoral thesis was to contribute to the prevention and management of obesity-related chronic pathologies derived from unhealthy eating habits and lifestyle through different individual or combined interventions (seed-derived nutraceutical and physical exercise vs. pharmacological treatment) and to promote environmental sustainability strategies. To this end, the work of this doctoral thesis was divided into two phases: 1) with the aim of developing in Sprague-Dawley rats the experimental model of diet-induced obesity suitable for the study of associated alterations such as non-alcoholic liver disease, insulin resistance and intestinal dysbiosis; and 2) with the aim of testing the effect of different interventions (on an application of calorie restriction): nutraceutical developed from seeds, high-intensity interval training protocol and GLP-1 receptor agonist drug, on obesity-induced alterations. In addition, the combined effect of the training protocol with the administration of the nutraceutical or the administration of the GLP-1 receptor agonist drug was studied. In this first phase, for the ideal development of the experimental animal model of diet-induced obesity, a high-fat high-fructose diet was fed in the drinking water for the mid- (13 weeks) and long term (21 weeks). As expected, the consumption of this obesogenic diet produced an increase in body weight, as well as the expected associated alterations of hepatic steatosis, oxidative stress, insulin resistance and intestinal dysbiosis. The different duration of the experimental period showed us that the mechanisms of hepatic fat accumulation were different: through de novo lipogenesis in the medium term, or the alteration of fatty acid catabolism by β-oxidation in the long term. To achieve the objectives of the second phase of work, 25 plant seeds, a waste product from the agri-food industry such as the pulp of Argania spinosa and the leaves of Salicornia spp. were screened by preparing functional extracts (ethanolic extracts and/or protein hydrolysates) with the aim of selecting those with the highest antioxidant capacity and extraction yield for the formulation and development of a nutraceutical. This nutraceutical was subjected to an in vitro digestibility process, and its antioxidant capacity was evaluated both by chemical tests and in the HT-29 and HepG2 cell lines. In addition, its ability to reduce triglyceride accumulation and lipotoxicity was evaluated in the AML12 cell line. Finally, the bioactive compounds and peptides present in the nutraceutical were tentatively identified by UPLC and HPLC, respectively. Secondly, based on the results obtained in the previous phase, a 16-week experimental period was selected for the in vivo trial: 8 weeks of obesity induction and 8 weeks of treatment with the administration of the nutraceutical, the completion of the training protocol and the injection of the drug semaglutide. The main results of this phase showed a high antioxidant capacity of the prepared functional extracts, and a high extraction yield that conditioned the selection of extracts for the formulation and development of the nutraceutical. This nutraceutical showed a broad profile of bioactive compounds that conferred a potent antioxidant and anti-steatotic effect. In addition, the nutraceutical showed no cellular toxicity, and the in vitro digestion process confirmed its high bioaccessibility. Administration of the nutraceutical in the developed experimental animal model of obesity showed a decrease in the activity of hepatic antioxidant enzymes, which corroborated its potent antioxidant effect found in the in vitro assays. In addition, its consumption produced a reduction in insulin resistance, decreasing the area under the curve following an oral glucose overload test (with greater efficacy than even the administration of the drug semaglutide). The beneficial effects of the nutraceutical were also reflected in its anti-inflammatory effect, the reduction of lipid metabolism imbalance and its marked prebiotic effect by reducing the Firmicutes/Bacteroidota ratio. As for the administration of the drug semaglutide, it promoted the reduction of hepatic steatosis, but showed side effects as it had a hypercholesterolemic action, as well as a pro-oxidant action in the liver, and a pro-inflammatory action in adipose tissue and, especially, in the colon, where it contributed to intestinal dysbiosis. Finally, the physical exercise protocol contributed effectively not only to body weight loss, but also to liver fat through activation of lipolytic pathways. The combination of physical exercise with the administration of the nutraceutical and semaglutide improved cardiopulmonary function by improving the aerobic capacity of the animals; in addition, the training protocol counteracted the negative effects of the drug administration on oxidative stress in the liver tissue. Finally, and by way of conclusion, we can say that all the interventions tested were beneficial for the treatment of diet-induced obesity through the loss of body weight or mostly through the effects found at the metabolic level. At the dose tested, the nutraceutical could be an important therapeutic tool, producing beneficial effects at different levels in the body and contributing to the recovery of health. This effect would be enhanced by physical exercise.