Estudio molecular y epidemiológico de enterobacterales productores de carbapenemasas resistentes a colistina

Abstract

Introducción La alta prevalencia de Enterobacterales productores de carbapenemasas (EPC) constituye una preocupación a nivel mundial por las altas tasas de mortalidad asociadas y las escasas opciones terapéuticas disponibles, lo cual ha llevado al uso de antibióticos considerados de último recurso como colistina y tigeciclina, sobre todo en regiones, como Ecuador, donde el acceso a los nuevos antimicrobianos es limitado. Colistina fue introducida para su uso clínico en el año 1949, pero debido a sus efectos secundarios, su uso se restringió para casos excepcionales. Sin embargo, su uso se está incrementado para el tratamiento de las EPC, por lo que la aparición de resistencia a este antimicrobiano, lo convierte en un problema con impacto clínico en la Salud Pública, por lo cual es necesario desarrollar esfuerzos para estudiar a fondo esta problemática para elaborar estrategias que permitan la prevención y el control de estos microorganismos multirresistentes. Esta tesis doctoral tiene como objetivo describir las características microbiológicas, moleculares y los factores de riesgo asociados a Enterobacterales productores de carbapenemasas y resistentes a colistina (EPC-RC), evaluando un método de laboratorio útil para su detección. Metodología Los artículos que componen esta tesis doctoral se pueden dividir en dos secciones: la primera que estudia la prevalencia, características microbiológicas y moleculares de EPC-RC, además de los factores de riesgo asociados; y la segunda parte que evalúa un método de laboratorio para la detección de la resistencia a colistina en EPC. La metodología utilizada se va a dividir de acuerdo con las secciones anteriormente mencionadas. Sección 1. Prevalencia, características microbiológicas y moleculares de EPC-RC, y factores de riesgo asociados Los artículos incluidos en esta sección se realizaron con aislados de EPC obtenidos durante tres periodos de tiempo (2016, 2020 y 2022) a partir de muestras clínicas y frotis rectales en hospitales de Ecuador. El estudio se inició con la selección de todos los Enterobacterales resistentes a carbapenémicos (según puntos de corte del CLSI del año de su aislamiento), posteriormente se confirmó la resistencia a carbapenémicos con el método de difusión por disco con meropenem y la producción de carbapenemasas por el método de inactivación de carbapenémicos. Todos los aislados de EPC fueron estudiados por el método de microdilución en caldo para determinar la resistencia a colistina, siguiendo la metodología del CLSI. Se realizó el ensayo de sinergia para la combinación colistina/fosfomicina por el método de tablero de ajedrez en aislados de Klebsiella pneumoniae productor de carbapenemasa. Los datos de los pacientes con infecciones por EPC se obtuvieron de los registros médicos electrónicos y las infecciones fueron definidas según el Centro de Prevención y Control de Enfermedades de Atlanta (CDC, por sus siglas en inglés). Para el análisis de los factores de riesgo, los casos incluyeron los pacientes infectados o colonizados con EPC-RC y el grupo control consistió en aquellos pacientes en los que no se aisló EPC-RC. La caracterización molecular de los aislados EPC-RC incluyó la detección de los genes blaKPC, blaNDM, blaOXA-48, blaVIM y blaIMP por una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) múltiple. En los aislados del año 2020, se determinaron las variantes de la carbapenemasa más frecuente (KPC) por el método de secuenciación de Sanger y se identificó la secuencia tipo por la técnica de Tipificación Multilocus de Secuencias (MLST, por sus siglas en inglés). Adicionalmente, se realizaron estudios de clonalidad con ERIC-PCR y determinación de resistencia plasmídica por presencia del gen mcr-1 en todos los aislados de EPCRC. Sección 2. Evaluación de un método de laboratorio para la detección de la resistencia a colistina en EPC. En este estudio se realizó la comparación del método de referencia (microdilución en caldo) para la determinación de susceptibilidad a colistina con el método de dilución en agar con una única concentración de colistina (3 mg/L), evaluando la concordancia categórica y errores menores en aislados de EPC-RC. Resultados Los resultados de este trabajo realizado en aislados de EPC-RC, obtenidos en diferentes ciudades de Ecuador, mostraron una prevalencia alta de resistencia a colistina (RC) (20,77%), la cual se incrementó en el período de estudio desde un 3,73% en el 2016 hasta un 23,73% en el 2022. Las muestras respiratorias fueron predominantes (27,40 % n=57/208), seguidas por las bacteriemias (25,48% n=53/208). K. pneumoniae fue el microorganismo aislado con mayor frecuencia (89,19%, n=322/361) aunque la resistencia a colistina también se presentó en K. aerogenes y E. cloacae. El análisis por microorganismo permitió identificar a K. aerogenes como el portador de mayor resistencia a colistina (52,94%; n=9). Los aislados EPC-RC mostraron altos niveles de co-resistencia a gentamicina y ciprofloxacino, mientras que la sensibilidad a tigeciclina, ceftazidima-avibactam (CIM90 < 0,12 mg/L) y meropenem-vaborbactam (CIM90 < 0,84 mg/L) fue alta (>90%). No se encontró sinergia con la combinación colistina y fosfomicina en aislados de K. pneumoniae blaKPC. El gen blaKPC fue el único involucrado en los aislados EPC-RC y no se detectó resistencia a colistina en los aislados productores de otras carbapenemasas como NDM y OXA-48. Los resultados del estudio de factores de riesgo demostraron una tasa de mortalidad de 42,2% en infecciones por EPC-RC y no se encontró ninguna diferencia en la mortalidad con los pacientes infectados por EPC-colistina sensibles. Las infecciones del tracto urinario fueron las infecciones más frecuentemente encontradas. La presencia de fallo renal, hemodiálisis en los 3 meses previos a la hospitalización, la presencia de catéteres para hemodiálisis y el uso de inhibidores de ß-lactamasas son factores de riesgo independientes para EPC-RC. El análisis de clonalidad con ERIC-PCR demostró que el 34,47% de los aislados obtenidos en el año 2020 en las unidades hospitalarias de la ciudad de Guayaquil, tenían 100% de similitud y se evidenció la presencia predominante (95,23%) de K. pneumoniae blaKPC-3 ST 512. El gen mcr-1 de origen plasmídico no fue identificado en ninguno de los aislados EPC-RC estudiados. Los resultados del estudio con el agar colistina-3 mg/L mostraron que este método de laboratorio tiene una excelente concordancia categórica (97,02%) con el método de referencia para identificar los EPC-RC. Conclusiones Existe una alta prevalencia de resistencia a colistina en EPC en las principales ciudades de Ecuador, la cual ha aumentado en el transcurso de los años. La resistencia a colistina no está mediada por el gen de origen plasmídico mcr-1, lo cual sugiere la presencia de otros mecanismos involucrados que requieren futuras investigaciones. Adicionalmente, los aislados de EPC-RC detectados se consideran extremadamente resistentes por sus co-resistencias, por lo cual se debe garantizar el acceso a los nuevos antimicrobianos disponibles debido a las altas tasas de mortalidad asociadas a las infecciones por EPC-RC. No se encontró sinergia en la combinación colistinafosfomicina. La prevalencia de infección por EPC-RC es del 28,07%, siendo K. pneumoniae ST 512-KPC-3 la responsable de la diseminación clonal de estos microorganismos multirresistentes, lo cual evidencia la falta de adherencia al Plan Nacional de Resistencia Antimicrobiana en Ecuador. Los factores de riesgo independientes asociados a la presencia de EPC-RC son la nutrición parenteral, hemodiálisis reciente, el uso de inhibidores de ß-lactamasas y el fallo renal. El agar Colistina 3 mg/L puede ser considerado como una buena alternativa para llevar a cabo , en los laboratorios de microbiología clínica con recursos limitados, la detección de EPC-RC en el ámbito clínico y con fines epidemiológicos. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral permiten comprender la problemática de los EPC-RC en Ecuador y aportan datos que pueden ser útiles en regiones similares con bajos recursos, los cuales sirven para elaborar estrategias que permitan la prevención y control de estos microorganismos.

Introduction The high prevalence of Carbapenemase-producing Enterobacterales (CPE) is a worldwide concern due to the high associated mortality rates and the few therapeutic options available, which has led to the use of antibiotics considered as last resorts such as colistin and tigecycline, especially in regions, such as Ecuador, where access to new antimicrobials is limited. Colistin was introduced for its use in 1949, but due to its side effects, its use was restricted to exceptional cases. However, its use is increasing for the treatment of CPE, so the emergence of resistance to this antimicrobial, turns it into a problem with clinical and Public Health impact, requiring developing efforts to thoroughly study this problematic to be able to develop strategies that allow the prevention and control of the multidrug-resistant pathogens. Methodology The articles that are part of this doctoral thesis can be divided into two sections: The first one, that studies the incidence, microbiological and molecular characteristics of CPE-RC and in addition the risk factors associated with CPE-CR. The second part is made up of the article that evaluates a laboratory method for the detection of colistin resistance in CPE. The methodology used will be divided according to the sections. Section 1. Prevalence, microbiological and molecular characteristics of CPE-RC and associated risk factors. The articles included in this section were carried out with CPE isolates obtained during three time periods (2016, 2020 and 2022) from clinical samples and rectal swabs in Ecuadorian hospitals. The study began with the selection of all Enterobacterales resistant to carbapenems (according to CLSI breakpoints of the year of their isolation), subsequently resistance to carbapenems was confirmed with the disk diffusion method with meropenem and carbapenemase-production was checked with carbapenem inactivation method. All CPE isolates were tested by the broth microdilution method to determine resistance to colistin following the CLSI methodology. Sinergy measurements by checkboard analysis was made in colistin-fosfomycin combination in Klebsiella pneumonie carbapenemase -producing. Patient’s data was obtained from electronic medical records. For the analysis of risk factors, cases included patients infected or colonized with CPE-CR and the control group consisted of those patients with CPE-colistin susceptible. The molecular characterization of CPE-CR included the detection of blaKPC, blaNDM, blaOXA-48, blaVIM and blaIMP genes by multiplex PCR. In the 2020 isolates, the most frequent carbapenemase variants (KPC) were determined by Sanger sequencing method and the sequencetype was studied with Multilocus Sequence Typing. Additionally, clonality studies were carried out with ERIC-PCR. The mcr-1 gene was studied in all EPC-CR isolates. Section 2. Evaluation of a laboratory method for the detection of colistin resistance in CPE. In this study, a comparison of the reference method (broth microdilution ) for determining susceptibility to colistin was carried out with the agar dilution method using a single concentration of colistin (3 mg/L) evaluating categorical agreement and minor errors in CPE-CR isolates. Results The results of this work carried out on CPE-CR isolates obtained in different cities in Ecuador, showed a high prevalence of CR (20.77%), which increased in the study period from 3.73% in 2016 to 23.73% in 2022. Respiratory samples were predominant (27.40%; n= 57/208), followed by bacteremia (25.48%; n: 53/208). K. pneumoniae was the most prevalent isolated microorganism (89.19%; n:322/361) although CR also occurred in K. aerogenes and E. cloacae. The analysis by microorganisms allowed the identification of K. aerogenes as the carrier of the greatest resistance to colistin (52.94%; n=9). CPE-RC isolates showed high levels of co-resistance to gentamicin and ciprofloxacin, while susceptibility to tigecycline, ceftazidime-avibactam and meropenem-vaborbactam was high (90%). No positive synergy was found with the combination colistin and fosfomycin in K. pneumoniae blaKPC isolates. The blaKPC gene was the only one involved in the CPE-CR isolates and no resistance to colistin was detected in the isolates producing other carbapenemases such as NDM and OXA-48. The results of the risk factor study demonstrated a mortality rate of 42.2% in CPE-CR infections and no difference in mortality was found with patients infected with CPE-colistin susceptible. Urinary tract infection was the most frequently infection found, and multivariate analysis showed that renal failure, hemodialysis in the 3 months prior to hospitalization, the presence of hemodialysis catheters and the use of -lactamase inhibitors are associated with CPECR. The clonality analysis with ERIC-PCR showed that 34.47% of the isolates obtained in 2020 in the hospital’s units of Guayaquil city had 100% similarity and the predominance of K. pneumoniae ST-512 KPC-3 was evident (95.232%). The mcr-1 gene was not identified in any of the CPE-CR isolates studied. The results of the study with colistin agar (3 mg/L) showed that this laboratory method has excellent categorical agreement (97.02%) with the reference method to identify CPE-CR. Conclusions There is a high prevalence of CR in CPE in the main cities of Ecuador, which has increased over the years. The absence of the gene of plasmid origin mcr-1 in the isolates tested, suggests the presence of other mechanisms involved that require further investigations. It can be added that CPE-CR isolates are considered extremely resistant due to their co-resistance, so access to the new available antimicrobials such as ceftazidime/avibactam or meropenem/vaborbactam should be guaranteed, due to the high associated mortality rates. No synergy was found in the combination colistin-fosfomycin. The prevalence of CPE-CR infections is 28.07%, being K. pneumoniae ST-512-KPC-3 responsible for the clonal dissemination of these multidrug-resistant microorganism, which shows the lack of adherence to the National Antimicrobial Resistance Plan in Ecuador. Additionally, we can mention that the independent risk factors associated with carrying EPC-RC are parenteral nutrition, recent hemodialysis, use of ß-lactamase inhibitors and kidney failures. Colistin agar 3 ug/ml, could be considered as a good alternative for implement in clinical microbiology laboratories with limited resources for CPE-CR detection in clinical and epidemiological settings The results obtained in his doctoral thesis allow us to understand the problem of CPE-CR in Ecuador and provide data that can be useful in similar regions with low resources, which serve to develop strategies that allow the prevention and control of these multidrug-resistant microorganisms.