Efecto de los compuestos bioactivos del aceite de oliva virgen en piel generada mediante ingeniería tisular

Abstract

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano. Está en contacto con el medio exterior y cumple una importante función de protección frente a diversos agentes tanto físicos, químicos como biológicos. Las lesiones de la piel, especialmente las quemaduras graves, se presentan como una situación crítica para la vida de los pacientes, ya que se pierde la integridad de este órgano y se ve comprometida su función. El método de referencia para el tratamiento de estas afecciones es la utilización de autoinjertos de piel procedente de las zonas sanas del paciente. Sin embargo, esta técnica presenta algunas limitaciones como son la escasez de zonas sanas en los pacientes grandes quemados y la alta morbilidad asociada. Por este motivo, se hace necesaria la búsqueda y la aplicación de nuevos métodos terapéuticos. En este sentido, la Ingeniería Tisular aparece como una nueva herramienta en el campo de la Biomedicina que permite generar sustitutos artificiales de diferentes tejidos humanos, como es la piel. El proceso de biofabricación de piel artificial consiste en la utilización de los queratinocitos y los fibroblastos procedentes de una biopsia de piel sana del paciente en combinación con diferentes biomateriales. Aunque estos sustitutos de piel ya han sido utilizados en pacientes grandes quemados y han demostrado su utilidad clínica, existen algunos inconvenientes en su proceso de fabricación. Una de las grandes limitaciones es el lento crecimiento de los queratinocitos humanos en cultivo, lo que prolonga el tiempo de generación de la piel artificial y retrasa su implantación en pacientes críticos. Por este motivo, en la presente Tesis Doctoral se han probado varias moléculas bioactivas procedentes del aceite de oliva virgen que han demostrado tener un gran poder antioxidante y antiinflamatorio en diversos estudios previos. En concreto, se estudió el ácido maslínico, extracto fenólico, DL-3,4-dihidroxifenil glicol y oleuropeína con el objetivo de mejorar los protocolos de cultivo de los queratinocitos para la optimización del proceso de biofabricación de la piel artificial mediante Ingeniería Tisular. En este sentido, en la presente Tesis Doctoral se evaluó, en primer lugar, el efecto de un amplio rango de concentraciones (1-80 μg/mL) de cada uno de los compuestos bioactivos sobre cultivos de queratinocitos humanos de piel inmortalizados a las 24, 48 y 72 horas de incubación. En cada uno de estos tiempos, se realizaron ensayos de viabilidad y de proliferación celular que permitieron determinar, para cada uno de los compuestos, la concentración óptima. Los resultados mostraron que 5 μg/mL de ácido maslínico, 10 μg/mL de extracto fenólico y 5 μg/mL de oleuropeína eran las concentraciones capaces de inducir un efecto pro-proliferativo sobre las células sin causar efectos citotóxicos en ellas. Estos compuestos, a las concentraciones establecidas, fueron elegidos para realizar el resto de ensayos de la presente Tesis Doctoral. Por el contrario, el DL-3,4-dihidroxifenil glicol no se empleó en los siguientes estudios, debido a que no consiguió producir efectos significativos sobre los cultivos. A continuación, se realizó un análisis de expresión génica en los queratinocitos cultivados con las concentraciones elegidas de ácido maslínico, extracto fenólico y oleuropeína. Estos análisis revelaron que los genes relacionados con la proliferación celular MKI67 y PCNA se encontraban sobreexpresados cuando se utilizaban estos compuestos bioactivos en los cultivos con respecto a aquellos en los que no se adicionaron dichos compuestos. Una vez comprobado el efecto proliferativo de los compuestos bioactivos sobre los queratinocitos humanos inmortalizados, se evaluaron estas condiciones sobre queratinocitos humanos de piel normales obtenidos de biopsias de pacientes, ya que son estas células las que se utilizan en el proceso de generación de la piel artificial mediante Ingeniería Tisular. Con tal fin, se establecieron cultivos primarios de queratinocitos humanos y se cultivaron en presencia de 5 μg/mL de ácido maslínico, 10 μg/mL de extracto fenólico y 5 μg/mL de oleuropeína durante 21 días, realizándose un contaje del número de colonias en cada una de las condiciones a la finalización del estudio. El ácido maslínico y el extracto fenólico fueron los únicos compuestos capaces de aumentar de forma significativa el número de colonias con respecto al grupo control. Finalmente, se generaron sustitutos de piel artificial combinando fibrina y agarosa, como biomaterial, y células de la piel humana (fibroblastos y queratinocitos). Estos constructos se funcionalizaron con 5 μg/mL de ácido maslínico, 10 μg/mL de extracto fenólico, 5 μg/mL de oleuropeína y una mezcla de todas las moléculas bioactivas a las concentraciones elegidas, y se mantuvieron en cultivo durante 24 horas y 4, 8 y 12 días. En cada uno de estos tiempos se evaluó el desarrollo de la epidermis, así como también su proliferación y diferenciación mediante técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas empleando varios marcadores. A rasgos generales, se observó que 10 μg/mL de extracto fenólico era capaz de aumentar de forma significativa el espesor y el número de estratos epiteliales formados en los constructos de piel artificial. Asimismo, los resultados revelaron un incremento en la diferenciación del epitelio en presencia de esta biomolécula a tiempos largos. En conclusión, la presente Tesis Doctoral demuestra, por un lado, que los compuestos bioactivos utilizados son seguros para los queratinocitos, ya que no producen en ellas efectos deletéreos. Por otro lado, todos los compuestos, excepto el DL-3,4-dihidroxifenilglicol, son capaces de inducir la proliferación de forma significativa en los tiempos estudiados con respecto a células sin tratar. Además, los resultados demuestran que estos mismos efectos se mantienen cuando los compuestos bioactivos se añaden sobre cultivos primarios de queratinocitos humanos normales. Por último, la funcionalización de los sustitutos de piel artificial con el extracto fenólico permitió su mejora en términos de proliferación y diferenciación del epitelio. Sin embargo, a pesar de los resultados prometedores recogidos en la presente Tesis Doctoral, se hace necesaria la realización de estudios futuros para determinar su posible traslación clínica.