Platelet-derived markers and mass cytometry for high-dimensional phenotyping of circulating tumor cells in prostate cancer

Abstract

Cancer is a complex disease in which heterogeneous populations of tumor cells interact with the tumor microenvironment, made up of a wide variety of cell subtypes. In addition, it is a dynamic and adaptive disease that evolves. The appearance of liquid biopsy in the repertoire of diagnostic and prognostic tests for prostate cancer has revolutionized not only the clinical scenario but also the knowledge about carcinogenesis and tumor dissemination processes. In this context, circulating tumor cells (CTCs) have been extensively studied in blood samples from cancer patients for their usefulness as indicators of tumor burden and tumor-specific characteristics. There is a great variety of techniques designed for the isolation, detection, and enumeration of CTCs and the study of some of their phenotypic traits, which has made it possible to determine their clinical utility in advanced and metastatic prostate cancer. However, this clinical utility as a biomarker has not yet been sufficiently demonstrated in patients in the early stages. This thesis is proposed with the aim of deepening the characterization of CTCs by studying the interactions between tumor cells and the circulating microenvironment, focusing on the CTC-platelet interaction and the use of mass cytometry as a novel technique for the multiparametric characterization of CTCs. The results presented in this work demonstrated, for the first time, that platelets transfer structural components to tumor cells more efficiently than tumor cells to platelets, and also show that this transfer occurs through different interactions: direct contact, internalization of whole platelets, and extracellular vesicles. As a result, tumor cells are educated by platelets, which translates into phenotypic, genetic, and functional changes. After cell interaction, tumor cells showed decreased expression of epithelial markers, such as EpCAM, increased expression of platelet markers (CD61), and increased expression of epithelial-mesenchymal transition markers. In addition, functional changes were studied, associating tumor cell and platelet interaction to increased cellular proliferation rate. The CD61 transfer observed in vitro was validated in patients since CD61 was detected on the membrane of CTCs from patients diagnosed with localized and advanced prostate cancer. Tumor cell genetic background, interaction with the microenvironment and therapy pressure are responsible to promote CTC heterogeneity. This thesis also addresses the identification of different subpopulations of CTC in prostate cancer patients. To this end, a protocol was developed based on the use of time-of-flight mass cytometry (CyTOF) that allowed exhaustive enumeration and multiparametric characterization of CTCs. Using this methodology in studying CTCs is a challenge that has not been previously addressed. For this reason, it was proposed as a proof of concept in a limited number of patients that, although it has not allowed demonstrating the clinical benefit of the technique, has allowed the detection and characterization of CTCs, identifying phenotypic profiles with potential involvement in the treatment and management of localized and advanced PC patients.

El cáncer es una enfermedad compleja en la que poblaciones heterogéneas de células tumorales interactúan con el microambiente tumoral compuesto por una amplia variedad de subtipos celulares. Además, es una enfermedad dinámica y adaptativa que evoluciona a lo largo del tiempo. La aparición de la biopsia líquida en el repertorio de pruebas diagnósticas y pronósticas del cáncer de próstata ha revolucionado no solo el escenario clínico sino también el conocimiento sobre la carcinogénesis y los procesos de diseminación tumoral. En este contexto, las células tumorales circulantes (CTC) se han estudiado ampliamente en muestras de sangre de pacientes con cáncer por su utilidad como indicadores de la carga tumoral y características específicas del tumor. Existe una gran variedad de técnicas diseñadas para el aislamiento, detección y enumeración de las CTC y el estudio de algunos de sus rasgos fenotípicos, lo que ha permitido determinar su utilidad clínica en el cáncer de próstata avanzado y metastásico. Sin embargo, esta utilidad clínica como biomarcador aún no ha sido suficientemente demostrada en pacientes en estadios iniciales. Esta tesis se plantea con el objetivo de profundizar en la caracterización de CTCs mediante el estudio de las interacciones entre las células tumorales y el microambiente circulante, centrándose en la interacción CTC-plaquetas y el uso de la citometría de masas como técnica novedosa para la caracterización multiparamétrica de CTCs. Los resultados presentados en este trabajo demostraron, por primera vez, que las plaquetas transfieren componentes estructurales a las células tumorales de manera más eficiente que las células tumorales a las plaquetas, y también muestran que esta transferencia ocurre a través de diferentes mecanismos: contacto directo, internalización de plaquetas íntegras y vesículas extracelulares. Como resultado, las células tumorales son educadas por las plaquetas, lo que se traduce en cambios fenotípicos, genéticos y funcionales. Después de la interacción celular, las células tumorales mostraron una disminución de la expresión de marcadores epiteliales, como EpCAM, una mayor expresión de marcadores plaquetarios (CD61) y una mayor expresión de marcadores de transición epitelio-mesénquima. Además, se estudiaron los cambios funcionales, asociando la interacción de las células tumorales y las plaquetas con el aumento de la tasa de proliferación celular. La transferencia de CD61 observada in vitro se validó en pacientes ya que se detectó CD61 en la membrana de las CTC de pacientes diagnosticados de cáncer de próstata localizado y avanzado. La carga genética de las células tumorales, la interacción con el microambiente y la presión selectiva ejercida por la terapia son responsables de promover la heterogeneidad de las CTCs. Esta tesis también aborda la identificación de diferentes subpoblaciones de CTCs en pacientes con cáncer de próstata. Para ello, se desarrolló un protocolo basado en el uso de citometría de masas de tiempo de vuelo (CyTOF) que permitió la enumeración exhaustiva y la caracterización multiparamétrica de las CTCs. El uso de esta metodología en el estudio de CTCs es un desafío que no se ha abordado previamente. Por ello, se propuso como prueba de concepto en un número limitado de pacientes que, si bien no ha permitido demostrar el beneficio clínico de la técnica, sí ha permitido la detección y caracterización de las CTC, identificando perfiles fenotípicos con potencial implicación en el tratamiento y seguimiento de los pacientes de cáncer de próstata localizado y avanzado.