Role of the extracellular protease ADAMTS1 as an immunomodulatory molecule: studies in syngeneic tumour mouse models

Abstract

During the last decades, the way to study cancer has changed enormously. The former simplistic view defining tumours as a mass of cancer cells has evolved, consolidating now the co-participation of heterogeneous tumour and stromal cells, including fibroblasts, immune and endothelial cells, and also non-cellular components. Among the non-cellular constituents, the dynamism of the extracellular matrix is gaining great prominence, although more research is still needed. During tumour progression, remodelling of the extracellular matrix by proteases is essential for processes such as angiogenesis, invasion or immune regulation. In our group, we have been contributing to the knowledge of the extracellular protease ADAMTS1 (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 1), the first member described of the ADAMTS family. To date, ADAMTS1 is known by its controversial role in cancer depending on the tumour type and context. It participates in angiogenesis and metastasis, and recent research has showed that this and other members of the ADAMTS family are regulating the immune system in cancer and other diseases. Our earlier results showed that, whereas murine B16F1 melanoma tumours were reduced in deficient mice for ADAMTS1 (Ats1-KO), Lewis Lung Carcinoma (LLC) tumours were not affected in such background. Importantly, B16F1 and LLC tumours are highly immunogenic and sensitive to anti-angiogenic treatment, while LLC ones are poorly immunogenic and resistant. Knowing this different behaviour, we investigated how ADAMTS1 and its activities in the ECM could impact in those differences. Our studies using Ats1-KO mice to address stromal ADAMTS1 were complemented with Adamts1-inhibited tumour cell lines, focusing on its tumour origin. Although the initial evaluation of tumour vasculature already revealed a common increase of vessel density in Ats1-KO conditions in both models, we still needed to expand our approaches to explain these differences in growth. For that, the increasing interest of the immune regulation by extracellular proteases motivated us to evaluate the immune environment of the Ats1-KO mouse, first in healthy animals and later in tumour-bearing mice. Importantly, spleen and bone marrow of healthy animals displayed a proinflammatory phenotype, mostly represented by T cells, in Ats1-KO mice, although data on myeloid cells suggested a potential anti-inflammatory role. Then, we performed in vitro experiments with bone marrow-derived macrophages, revealing that their migratory and phagocytic abilities were compromised in the absence of the protease, without affecting adhesion and polarisation. Definitively, all these results define ADAMTS1 as an immunomodulatory molecule. Additional studies corroborated the distinct effect of these tumour cell lines on macrophage polarization, uncovering a main induction of a M2-protumorigenic phenotype by the conditioned media of LLC. Indeed, these assays allowed us to discover that the inhibition of ADAMTS1 in these cells provoked the polarisation of macrophages to an M1 pattern, suggesting the possible mediation of this effect by a variety of extracellular molecules such as Versican, osteopontin, IL33 and LDLR. Our later studies were focused on the contribution of ADAMTS1 in the tumour immune compartment. Interestingly, B16F1-Ats1-KO tumours resemble the healthy mice immune landscape. However, the presence of LLC tumours provoked major alterations in the immune landscape challenging the supposed advantages of the Ats1-KO mouse to reduce tumour growth. To confront this issue, we assessed RNA sequencing of tumours. These analyses of specific gene signatures related to inflammatory response and matrisome showed relevant differences. Interestingly, the comparison between B16F1-Ats1-KO and LLCAts1- KO tumours showed that the first ones had a reduced cell migration and motility and a higher T cell migration and chemotaxis, reflecting how the absence of ADAMTS1 modulates the differences that exist between the models. Finally, we addressed the possible common mechanisms between the antiangiogenic resistance of LLC tumours and the absence of effect of these tumours to the genetic deletion of ADAMTS1. Suggestively, these complex studies revealed that the absence of ADAMTS1 did not alter the final resistance of LLC model to our antiangiogenic therapy, involving myeloid-derived suppressor cells but also protumorigenic macrophages. Concluding, this work reinforce and emphasize the newly described immunomodulatory functions of ADAMTS1, mainly reflected in the alteration of immune populations in spleen, bone marrow and tumours, but also according to our functional assessments of macrophages. Among future perspectives, main actions need to be pursued to unveil the implication of type I interferon pathway or collagen organisation, for example. Nevertheless, studying the putative contribution of the proteoglycan Versican and its proteolysis needs to be specially highlighted according its recognized activities in macrophage polarisation and immunosuppression, even to be considered as a therapeutic target.

En las últimas décadas, la forma de estudiar el cáncer ha cambiado enormemente. La antigua visión simplista que consideraba un tumor como una masa de células tumorales similares entre sí ha evolucionado, consolidando la participación de otras células tumorales y células estromales como fibroblastos, células inmunes y endoteliales, y componentes no celulares. Dentro de esos componentes no celulares, el dinamismo de la matriz extracelular ha ganado interés, aunque se necesita un estudio más detallado. Durante la progresión tumoral, el remodelamiento de la matriz extracelular mediada por proteasas es esencial durante procesos como la angiogénesis, la metástasis o la regulación inmune. En nuestro grupo hemos contribuido al conocimiento acerca de la proteasa extracelular ADAMTS1 (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 1), primer miembro descrito de la familia ADAMTS. ADAMTS1 es conocida por su papel dual en cáncer según el tipo tumoral y el contexto, participando en angiogénesis, metástasis, y como ha sido recientemente descrito, en la regulación del sistema inmune en cáncer y otras patologías, al igual que otros miembros de la misma familia. Estudios preliminares de nuestro grupo muestran que el modelo murino de melanoma B16F1 se reduce al ser inyectado en ratones deficientes de la proteasa (Ats1-KO), mientras que el modelo Lewis Lung Carcinoma (LLC) no se ve afectado. Por otro lado, el modelo B16F1 se considera altamente inmunogénico y sensible a terapias anti-angiogénicas, al contrario que el modelo LLC, bajamente inmunogénico y resistente. Por todo ello, quisimos saber cómo ADAMTS1 y su actividad proteolítica regulaban esas diferencias. Para ello, usamos ratones Ats1-KO para evaluar la contribución de la proteasa estromal, e inhibimos la proteasa en las líneas celulares para evaluar su contribución tumoral. Aunque la evaluación inicial de la vasculatura mostraba un aumento similar de la densidad en ambos modelos en ratones Ats1-KO, se necesitan otros análisis para explicar el cambio en el crecimiento del tumor. Para ello, el interés que se está generando entorno a la regulación del sistema inmune mediante proteasas extracelulares nos hizo evaluar el ambiente inmune del ratón Ats1-KO en condiciones fisiológicas y tumorales. De manera relevante, la ausencia de ADAMTS1 generó un entorno pro-inflamatorio en bazo y médula ósea, principalmente debido a células T. Sin embargo, las poblaciones mieloides también sugieren un potencial ambiente anti-inflamatorio. Por otro lado, la caracterización in vitro de macrófagos derivados de médula ósea demostraron que la deficiencia de ADAMTS1 reducía su migración y fagocitosis, sin afectar su adhesión y capacidad para polarizarse. Por todo ello, estos resultados definen a ADAMTS1 como una molécula inmunomoduladora. Estudios adicionales demuestran la capacidad de las células tumorales en la polarización de macrófagos, mostrando una inducción de la polarización de macrófagos a M2 por parte del secretoma de las células LLC. Además, estos estudios nos permitieron describir que la inhibición tumoral de ADAMTS1 promovió la polarización de los macrófagos a M1, sugiriendo que moléculas como Versicano, osteopontina, IL33 y LDLR pueden mediar estos cambios Estudios posteriores acerca de la contribución de ADAMTS1 en la regulación inmune en el tumor reflejan que los tumores B16F1 en ratones Ats1-KO tienen un fenotipo similar al ratón sano. En cambio, la presencia de tumores LLC atenúan las posibles ventajas inmunes generadas por la ausencia de ADAMTS1 para reducir el tumor. Para confirmar estos cambios, llevamos a cabo una secuenciación del ARN de los tumores y analizamos firmas génicas concretas relacionadas con la respuesta inflamatoria y el matrisoma. De forma relevante, este estudio sugirió que los tumores B16F1-Ats1-KO mostraban una reducción de la migración celular y una mayor citotoxicidad mediada por células T que los tumores LLC-Ats1-KO, reflejando cómo la ausencia de ADAMTS1 modula las diferencias previamente mostradas entre los modelos tumorales. Finalmente, en este trabajo evaluamos posibles mecanismos comunes entre la ausencia de respuesta en el ratón Ats1-KO y la resistencia a fármacos antiangiogénicos del modelo LLC. Estos estudios demostraron que la reducción de ADAMTS1 no es capaz de modular dicha resistencia, la cual está mediada por células supresoras mieloides y macrófagos pro-tumorigénicos. En resumen, este trabajo refuerza y enfatiza las nuevas propiedades inmunomoduladoras descritas para la proteasa ADAMTS1, reflejadas principalmente por la alteración de poblaciones inmunes en bazo, médula ósea y tumores, pero también gracias a los ensayos funcionales realizados con macrófagos. Entre las perspectivas futuras de este trabajo, las líneas más importantes se centran en el estudio de la implicación de las rutas del interferón I y la formación de estructuras de colágeno, entre otras. Sin embargo, el estudio del papel del Versicano y su proteólisis necesitan un estudio más detallado de acuerdo a sus propiedades inmunosupresoras y a su participación en la polarización de macrófagos, debiendo considerarlo como una posible diana terapéutica.