Role of intestinal microbiota in obesity-associated colorectal cancer development: a novel target for pharmacological treatment

Abstract

El cáncer colorrectal (CRC) es uno de los cánceres con mayor incidencia, siendo el tercer cáncer más común y la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en el mundo. La etiología del CRC es multifactorial, combinando un componente genético heredado influenciado por numerosas condiciones ambientales como el sedentarismo, una dieta rica en carnes procesadas, consumo de alcohol, tabaquismo y varias enfermedades como las enfermedades inflamatorias intestinales (colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn) u obesidad. Entre estos factores de riesgo, el consumo de una dieta rica en grasas se ha relacionado estrechamente con el desarrollo de un estado de obesidad, lo que aumenta el riesgo de desarrollar CRC en casi un 10%. Las vías moleculares que intervienen en el desarrollo del CRC en personas obesas no están completamente descritas; sin embargo, se sabe que la desregulación del metabolismo, así como el estado inflamatorio crónico y la situación de disbiosis intestinal pueden contribuir a la aparición de CRC. De hecho, muchos estudios han descrito el papel de los metabolitos derivados de una microbiota alterada o disbiosis asociada a la obesidad en la promoción del CRC. Entonces, la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la relación obesidad y el CRC, especialmente aquellos asociados con la microbiota alterada, tiene un valor traslacional potencial para la terapia y el manejo del CRC, así como para prevenir el desarrollo de esta enfermedad en pacientes obesos. La modulación del microbioma es una de las estrategias más innovadoras de la medicina personalizada actual. De hecho, se ha descrito que pueden en un futuro mejorar la salud de las personas y reducir el riesgo de diferentes afecciones, entre ellas el cáncer, enfermedades metabólicas, inmunitarias, inflamatorias y degenerativas. En este escenario, los extractos de plantas obtenidos de las partes aéreas de Thymus serpyllum L. o de las hojas de Morus alba L. han demostrado ejercer propiedades prebióticas que se han asociado con actividades antiinflamatorias y antioxidantes. En consecuencia, han sido ampliamente utilizados en la medicina tradicional contra varias enfermedades relacionadas con la inflamación. Adicionalmente, las tetraciclinas son fármacos con demostradas propiedades antibióticas e inmunomoduladoras que han mostrado actividad citotóxica frente a diferentes tipos de cáncer. Estas terapias se han caracterizado por modular la disbiosis intestinal característica de ambas patologías, la obesidad y el CRC. A pesar de que se han logrado numerosos avances en la terapia de la obesidad y el CRC, los tratamientos actuales no siempre son bien tolerados o su eficacia es baja en una gran parte de grupos de pacientes. Todo lo anterior justifica la necesidad de más investigación centrada en la capacidad de los nuevos agentes para dirigirse a las vías celulares y moleculares alteradas en la obesidad y el CRC, especialmente en la disbiosis intestinal que comparten ambos trastornos. Para abordar esto, se propusieron los siguientes objetivos: 1. Evaluar estrategias terapéuticas capaces de modular la microbiota intestinal en el manejo de la obesidad. 2. Determinar dianas terapéuticas que impactan en la composición de la microbiota intestinal en el manejo del CRC. 3. Caracterizar el impacto de la obesidad en el desarrollo de CRC, estableciendo el papel de la microbiota intestinal como potencial diana terapéutica. Con estos objetivos, en primer lugar, se evaluó el impacto de dos extractos, de partes aéreas de Thymus serpyllum y hojas de Morus alba, en un modelo murino experimental de obesidad inducida por una ingesta de una dieta rica en grasa (HFD). Además, se estudió la actividad de estos extractos de plantas sobre los trastornos metabólicos asociados a la obesidad, el estado inflamatorio y redox, la disfunción endotelial y las alteraciones de la microbiota intestinal. Los hallazgos mostraron que ambos extractos mostraron un efecto positivo en el aumento de peso corporal inducido por la suplementación con HFD, que se asoció con una mejora de los perfiles de lípidos y glucémicos en plasma, así como con una reducción de los depósitos de grasa. Además, los extractos de Thymus serpyllum y Morus alba lograron mejorar significativamente la inflamación crónica que caracteriza al fenotipo obeso. En este sentido, los tratamientos regularon a la baja varios mediadores proinflamatorios como la expresión de IL-6, TNFɑ y ciclooxigenasa 2. Este efecto podría estar relacionado con la capacidad de los extractos para modular la microbiota intestinal y mejorar la función de barrera intestinal alterada, reduciendo así el acceso de los lipopolisacáridos (LPS) bacterianos intestinales a la corriente sistémica, y resultando en una menor endotoxemia metabólica en ratones obesos tratados. Además, la presencia de compuestos fenólicos en ambos extractos de plantas fue responsable de una mejora del estado de estrés oxidativo asociado con la obesidad. Por otro lado, se investigó el efecto de la tigeciclina, una tetraciclina de tercera generación, en modelos experimentales de CRC. Inicialmente, se estudió el impacto de este antibiótico sobre las líneas celulares de cáncer de colon, HCT116, Caco2 y CMT93, y se comparó con la actividad del 5-fluorouracilo, que constituye el fármaco estándar en la terapia del CRC. Posteriormente, y tras evidenciar los efectos antiproliferativos y proapoptóticos que la tigeciclina ejerció sobre las células tumorales, se profundizó en el estudio de los mecanismos moleculares implicados en estas acciones. Se observó que la tigeciclina dificultaba la activación de las vías proliferativas Wnt/β-catenina y JAK/STAT3, así como la activación de marcadores implicados en las diferentes vías de apoptosis estudiadas: extrínseca, intrínseca y mediada por retículo endoplásmico. Además, la tigeciclina ejerció un efecto beneficioso sobre las células madre del cáncer de colon (CSC), las cuales se relacionan con el inicio del proceso tumoral y una mayor malignidad de los cánceres debido a sus propiedades invasivas y metastásicas. Esta acción puede estar relacionada con la capacidad de la tigeciclina de interferir en la transición epiteliomesenquimatosa, principalmente asociada con una inhibición del factor de transcripción SNAI1. Todos estos efectos se relacionaron con una mejora significativa de la tumorigénesis in vivo en un modelo de xenotransplante tumoral y en el modelo de CRC asociado a colitis (CAC) en ratones. La administración de tigeciclina a ratones xenotrasplantados con CSC HCT116 resultó en una reducción del volumen tumoral y los niveles de CTNNB1 (β-catenina), un factor clave en la proliferación de células tumorales. Este efecto antiproliferativo de la tigeciclina también se observó en ratones CAC tratados con el antibiótico, y se asoció con una reducción del proceso inflamatorio y un aumento de las células T citotóxicas en los ganglios linfáticos mesentéricos de estos ratones. Además, la mitigación de la tumorigénesis observada con el tratamiento con tigeciclina se relacionó con un efecto proapoptótico in vivo, como lo demuestra el aumento de los niveles de caspasa 7. Finalmente, el antibiótico fue capaz de modular la microbiota intestinal, al promover el enriquecimiento en taxones bacterianos beneficiosos asociados con propiedades antiinflamatorias y antitumorales como Parabacteroides distasonis y Akkermansia sp. Finalmente, se estudió la asociación entre obesidad y CRC en un modelo murino de CRC asociado a obesidad mediante la administración de HFD a ratones, seguido de inducción de CAC con azoximetano (AOM) y dextrano sulfato de sodio (DSS). Se observó un agravamiento de la tumorigénesis en los ratones no tratados alimentados con HFD en comparación con los que recibieron una dieta estándar (SD), caracterizada por un aumento de la malignidad del tumor y la invasión a los tejidos submucosos. Además, los ratones alimentados con HFD no tratados exhibieron una regulación positiva de las citocinas derivadas del tejido adiposo, como la IL-6, que puede contribuir a la tumorigénesis. Asimismo, también se informaron cambios en la microbiota intestinal en estos ratones cuando se analizó la diversidad beta. Curiosamente, se observó un aumento significativo del género Alistipes en ratones alimentados con HFD no tratados con CAC en comparación con los alimentados con SD. Finalmente, también se estudió el efecto de la tigeciclina en este modelo de CRC asociado a obesidad y se encontró que ejercía un impacto similar al obtenido en el estudio previo realizado en ratones CAC. En resumen, la tigeciclina pudo interferir con las vías moleculares implicadas en la proliferación celular y modular la respuesta inmunitaria hacia una respuesta antiinflamatoria con actividad linfoide mejorada. Con respecto al impacto del tratamiento de la tigeciclina en la microbiota intestinal de ratones alimentados con HFD, el tratamiento pudo aumentar significativamente los niveles de Parabacteroides goldsteinii y Akkermansia mucinifiphila, estando ambas especies bacterianas asociadas con una mejora de la enfermedad del cáncer. En resumen, en la presente Tesis se ha realizado un análisis detallado de las terapias moduladoras de la microbiota intestinal basadas en el uso de los prebióticos Thymus serpyllum o Morus alba, así como del antibiótico tigeciclina, describiendo su impacto en modelos de obesidad, CRC y CRC asociado a obesidad. Además, la evidencia de los mecanismos moleculares implicados en los efectos beneficiosos que ejercen estos compuestos ha sido ampliamente descrita, prestando especial atención a aquellos cambios inducidos en la microbiota intestinal. Por tanto, el desarrollo de esta Tesis Doctoral tiene como objetivo proporcionar una mejor comprensión de la asociación obesidad-CRC, así como la búsqueda de nuevas terapias basadas en la modulación de la microbiota intestinal que contribuyan a la mejora de las terapias existentes para la obesidad y el CRC.

Colorectal cancer (CRC) is one of the cancers with the highest incidence, being the third most common cancer and the second leading cause of cancer-related deaths in the world. The etiology of CRC relies on the combination of multiple factors, including an inherited genetic component influenced by numerous environmental conditions such as sedentarism, a diet rich in processed meats, alcohol consumption, tobacco use and several diseases such as inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis and Crohn’s disease) or obesity. Among these risk factors, the consumption of a high-fat diet (HFD) has been closely linked to the development of an obesity status, which increases the risk of CRC development by almost 10%. The molecular pathways that are involved in the development of CRC in obese individuals are not fully described; however, it is known that the deregulation of metabolism as well as the chronic inflammatory state and the gut dysbiosis situation can contribute to CRC occurrence. In fact, many studies have reported the role of metabolites derived from an obesity-associated dysbiotic microbiota in CRC promotion. Then, the understanding of the molecular mechanisms involved in the crosstalk between obesity and CRC, especially those associated with the altered microbiota, has a potential translational value for CRC therapy and management, as well as for preventing the development of this disease in obese patients. Microbiome modulation is one of the novel strategies in medicine with the greatest future to improve the health of individuals and reduce the risk of different conditions, including cancer, metabolic, immune, inflammatory and degenerative diseases. In this scenario, plant extracts obtained from the aerial parts of Thymus serpyllum L. or the leaves of Morus alba L. have been shown to exert prebiotic properties that have been associated with antiinflammatory and antioxidant activities. Consequently, they have been widely used in traditional medicine against several inflammatory-related diseases. Additionally, tetracyclines are drugs with proven antibiotic and immunomodulatory properties that have demonstrated cytotoxic activity against different types of cancer. These therapies have been characterized by modulating the gut microbiota, which is altered in both pathologies, obesity and CRC. Despite numerous advances have been achieved in the therapy of obesity and CRC, the current treatments are not always well tolerated and/or lack efficacy can occur in certain population groups. All the above justifies the necessity of further research focusing on the capacity of new agents to target the cellular and molecular pathways altered in obesity and CRC, especially in the gut dysbiosis that isd shared in both disorders. In order to address this, the following objectives were proposed: 1. To evaluate therapeutic strategies able to modulate the gut microbiota in the management of obesity. 2. To assess therapeutic strategies able to modulate the gut microbiota in the management of CRC. 3. To characterize the impact of obesity in the development of CRC, establishing the role of the intestinal microbiota as potential therapeutic target. With these aims, first, the impact of two extracts, from Thymus serpyllum aerial parts and Morus alba leaves, were evaluated in an experimental murine model of obesity induced by a HFD intake. Moreover, the activity of these plant extracts on obesity-associated metabolic disorders, inflammatory and redox status, endothelial dysfunction as well as gut microbiota alterations were studied. The findings showed that both extracts showed a positive effect on the body weight gain induced by the HFD-supplementation, which was associated with an amelioration of the plasma glycemic and lipid profiles, as well as with a reduction of the fat deposits. Moreover, Thymus serpyllum and Morus alba extracts were able to significantly improve the chronic inflammation that characterizes the obese phenotype. In this sense, the treatments downregulated several pro-inflammatory mediators such as IL-6, TNFɑ and cyclooxygenase 2 expression. This effect could be related with the capacity of the extracts to modulate gut microbiota and ameliorate the altered gut barrier function, thus reducing the access of intestinal bacterial lipopolysaccharide (LPS) to the systemic stream, and resulting in a lower metabolic endotoxemia in obese-treated mice. Additionally, the presence of phenolic compounds in both plant extracts were responsible for an amelioration of the oxidative stress status associated with obesity. Then, the effect of tigecycline, a third generation tetracycline, was investigated in experimental CRC models. Initially, the impact of this antibiotic on colon cancer cell lines, HCT116, Caco2 and CMT93, was studied and compared with the activity of 5- fluorouracil, which constitutes the standard drug in the therapy of CRC. Subsequently, and after evidencing the antiproliferative and proapoptotic effects exerted by tigecycline on tumor cells, the molecular mechanisms involved in these actions were further studied. It was observed that tigecycline hindered the activation of the Wnt/β-catenin and JAK/STAT3 proliferative pathways, and also the activated markers involved in the different programmed death pathways studied: extrinsic, intrinsic and endoplasmic reticulum-mediated apoptosis. Moreover, tigecycline exerted a beneficial effect against colon cancer stem cells (CSCs), which are related to the initiation of the tumor process and a greater malignancy of cancers due to their invasive and metastatic properties. This action may be related to the capacity of tigecycline to interfere with the epithelial mesenchymal transition, mainly related with an inhibition of the transcription factor SNAI1. All these effects were associated with a significant amelioration of the tumorigenesis in vivo in a tumor xenograft model and in the colitis-associated CRC (CAC) model in mice. Tigecycline administration to mice xenotransplanted with HCT116 CSCs resulted in a reduction of tumor volume and CTNNB1 (β-catenin) levels, a key player in tumor cell proliferation. This anti-proliferative effect of tigecycline was also observed in CAC mice treated with the antibiotic and was associated with a reduction of the inflammatory process and an increase in cytotoxic T cells in mesenteric lymph nodes in these mice. Moreover, the mitigation of the tumorigenesis observed with tigecycline treatment was linked to a proapoptotic effect in vivo, as evidenced by increased levels of caspase 7. Finally, the antibiotic was able to modulate the intestinal microbiota, by promoting enrichment in beneficial bacterial taxa associated with antiinflammatory and antitumor properties such as Parabacteroides distasonis and Akkermansia sp. Finally, the association between obesity and CRC was studied in a murine model of obesity-associated CRC through the administration of a HFD to mice, followed by CAC induction with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). An aggravation of tumorigenesis was observed in those untreated mice fed a HFD in comparison with those that received a standard diet (SD), characterized by increased malignancy of tumor and invasiveness of submucosal tissues. Moreover, untreated HFD-fed mice exhibited an upregulation of cytokines derived from adipose tissue such as IL-6 that can contribute to tumorigenesis. Additionally, changes in gut microbiota were also reported in these mice when beta diversity was analyzed. Interestingly, a significant increase of Alistipes genus was observed in untreated HFD-fed mice with CAC compared to those fed a SD. Finally, the effect of tigecycline was also studied in this model of obesity-associated CRC and it was found to exert a similar impact to that obtained in the previous study carried out in CAC mice. Briefly, tigecycline was able to interfere with the molecular pathways involved in cell proliferation and modulate the immune response towards an antiinflammatory response with enhanced lymphoid activity. Regarding the effect of tigecycline in gut microbiota of HFD-fed mice, the treatment was able to significantly increase the levels of Parabacteroides goldsteinii and Akkermansia mucinifiphila, being both bacterial species associated with an amelioration of the cancer disease. In summary, a detailed analysis of intestinal microbiota modulating therapies based on the use of the prebiotics Thymus serpyllum or Morus alba, as well as the antibiotic tigecycline, has been carried out in the present Thesis, describing their impact on models of obesity, CRC and obesity-associated CRC. Furthermore, evidence of the molecular mechanisms involved in the beneficial effects exerted by these compounds has been widely described, paying particular attention to those changes induced in the gut microbiota. Therefore, the development of this Doctoral Thesis aims to provide a better understanding of the obesity-CRC association, as well as the search for new therapies based on the modulation of the intestinal microbiota that contribute to the improvement of existing therapies for obesity and CRC.