Study of novel biomarkers and molecular therapies against lung cancer

Abstract

Cancer is a global health emergency nowadays, and lung cancer is the subtype with the highest mortality overall. Understanding the molecular mechanisms that originate tumors has been the focus of cancer research in the last decades. This has allowed us to discover novel biomarkers for improving the diagnosis and the prognosis of patients, and to design novel targeted therapeutic strategies. Despite the many advances, lung cancer still accounts for millions of deaths worldwide every year, and the 5-year survival rate remains at around 20%. There is therefore an urgency to continue studying this disease, and to develop novel biomarkers and targeted therapies to improve the diagnosis, prognosis, and treatment of lung cancer patients. In this thesis, we have aimed to increase our understanding of the molecular biology of lung cancer from two different angles: 1. Identification of novel non-coding RNAs as lung cancer biomarkers. The identification of frequently dysregulated or mutated genes in cancer is of the utmost importance for the discovery of novel diagnostic/prognostic biomarkers, and potential novel targets for molecular therapy. However, to date most of the research has been focused on the protein-coding part of the genome, often overlooking non-coding RNAs, such as micro-RNAs (miRNAs) and long noncoding RNAs (lncRNAs). Non-coding RNAs exert key roles in gene expression regulation and appear altered in several diseases, including lung cancer. Therefore, in this thesis we have focused on discovering altered lncRNAs and miRNAs in lung adenocarcinoma (LUAD) patients, to characterize them and validate their oncogenic potential and possible use as biomarkers. Thus, we have discovered a lncRNA, DLG2-AS1, which we found to be downregulated in a cohort of 65 LUAD patient samples (44/65), compared to their paired, adjacent non-tumor tissues. DLG2-AS1 showed an area under curve (AUC) of 0.726, which represents a good biomarker potential compared to other already validated lncRNA and protein biomarkers. We also aimed to demonstrate the tumor suppressor role of DLG2-AS1, and its cis-regulatory role over the overlapping gen DLG2 in LUAD cell lines. However, we observed no phenotypical differences upon its overexpression, nor did we find a correlation between DLG2- AS1 and DLG2 expression in our models. Furthermore, we also studied the oncogenic potential of a miRNA, miR- 133b, which was found somatically mutated in its seed region in a previous miRNA study in LUAD patients. The overexpression of mutant and wildtype versions of miR-133b in LUAD cell lines showed a strong oncogenic effect of mutant miR-133b in the A549 and H2126 cell lines, compared to its wildtype version. A subsequent RNA sequencing analysis provided us with a series of downregulated cancerrelated genes (e.g., TAGLN2, and PTBP for wildtype; QKI, and RHOQ for mutant) which could explain the phenotype we observed if they are proven targets for miR- 133b in future experimental validations. 2. Development of novel molecular therapies based on the CRISPR/Cas9 system. On the other hand, some frequently mutated genes can serve not only as biomarkers, but also as targets for molecular therapies against cancer, such as the oncogene KRAS, which is the most frequently mutated driver oncogene in LUAD. For years, mutant KRAS has been an elusive target for therapy until just recently, with two novel drugs targeting KRASG12C mutant tumors having reached the clinic since 2021: sotorasib and adagrasib. However, these drugs have faced some difficulties in late-phase clinical trials, as most of the patients develop resistances and eventually relapse in a one-year time. Therefore, novel strategies for targeting KRAS-mutant tumors need to be explored, and the CRISPR/Cas9 technology might be the solution. CRISPR/Cas9 can specifically delete mutant alleles of a target gene without affecting the wildtype, non-tumor one, therefore selectively eliminating tumor cells harboring such mutations. We aimed to optimize the design and delivery, and to test the specificity and efficiency of a novel molecular therapy against KRASG12C/G12D LUAD using the CRISPR technology and a high-fidelity version of Cas9 (CRISPR-KRAS therapy). After assessing the specificity of the designed single-guide RNAs, our CRISPR-KRAS therapy successfully caused a ~70% reduction in cell viability in KRAS-mutant LUAD cell lines, without affecting KRASwildtype cells. Finally, the cellular mechanisms by which tumor cells become resistant to targeted therapies against oncogenes can be studied by performing a highthroughput CRISPR screening. This allows us to discover the collateral dependencies that arise in the surviving cells after knocking out an oncogene. To apply this cutting-edge technology, we performed a CRISPR-screening on knockout (KO) clones previously generated in our laboratory for a squamous cell lung cancer (LUSC) oncogene, PKP1. After the screening, we discovered that the most essential genes for PKP1-KO clones included a large number of genes implicated in mitochondrial translation and transcription termination, such as MTERF4 and several mitoribosome proteins. This opens a new line of research for a future targeted co-therapy against LUSC, which could involve PKP1 inhibition along with some mitochondrial translation inhibitor antibiotics, to enhance its effect and prevent resistances.

Actualmente el cáncer es una emergencia sanitaria global, y el cáncer de pulmón el subtipo con una mayor mortalidad. Entender los mecanismos moleculares que originan los tumores ha sido el foco de la investigación oncológica en las últimas décadas. Esto nos ha permitido descubrir nuevos biomarcadores para mejorar el diagnóstico y el pronóstico de los pacientes, y diseñar nuevas estrategias terapéuticas dirigidas. A pesar de los muchos avances, el cáncer de pulmón es aún responsable de millones de muertes cada año en el mundo, y la tasa de supervivencia a 5 años se mantiene en torno al 20%. Hay, por tanto, una urgencia en continuar estudiando esta enfermedad, y en desarrollar nuevos biomarcadores y terapias dirigidas que mejoren el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de los pacientes. En esta tesis se ha tratado de incrementar el conocimiento sobre la biología molecular del cáncer de pulmón desde dos ángulos distintos: 1. Identificación de nuevos ARN no codificantes como biomarcadores de cáncer de pulmón. La identificación de genes frecuentemente desregulados o mutados en cáncer es de vital importancia para el descubrimiento de nuevos biomarcadores diagnósticos/pronósticos, así como potenciales nuevas dianas terapéuticas. Sin embargo, la mayoría de los estudios hasta la fecha se han centrado en la parte codificante del genoma, a menudo olvidando los ARN no codificantes, tales como micro-ARN (miRNA) y ARN largos no codificantes (lncRNA). Los ARN no codificantes ejercen funciones reguladoras de la expresión génica muy importantes y aparecen alterados en numerosas enfermedades, incluido el cáncer de pulmón. Por tanto, en esta tesis nos hemos centrado en hallar lncRNA y miRNA alterados en pacientes con adenocarcinoma de pulmón (LUAD), para caracterizarlos y validar su potencial oncogénico y posible uso como biomarcadores. Así, hemos descubierto un lncRNA, DLG2-AS1, que aparece regulado a la baja en muestras tumorales de una cohorte de 65 pacientes de LUAD (44/65), comparado con sus respectivas muestras pareadas no tumorales. DLG2-AS1 mostró un área bajo la curva (AUC) de 0,726; lo que representa un buen potencial como biomarcador comparado con otros lncRNA y proteínas biomarcadores ya validados. También intentamos demostrar el papel como supresor tumoral de DLG2-AS1 y su papel regulador en cis sobre el gen solapante DLG2 en líneas celulares de LUAD, pero no conseguimos observar ninguna diferencia fenotípica tras su sobreexpresión, ni vimos una correlación entre los niveles de expresión de DLG2-AS1 y DLG2 en nuestros modelos. Además, estudiamos el potencial oncogénico de un miRNA, miR-133b, el cual se halló mutado somáticamente en su región semilla en un estudio previo de miRNA en pacientes con LUAD. La sobreexpresión de las versiones mutante y silvestre de miR-133b en líneas celulares de LUAD nos mostraron un fuerte efecto oncogénico de miR-133b mutante en las líneas A549 y H2126 comparado con su versión silvestre. Un análisis de secuenciación de ARN posterior nos reveló una serie de genes relacionados con cáncer (p. ej., TAGL2 y PTBP1 para el silvestre; QKI y RHOQ para el mutante) regulados a la baja que podrían explicar el fenotipo observado si demuestran ser dianas de miR-133b en futuras validaciones experimentales. 2. Desarrollo de nuevas terapias moleculares basadas en el sistema CRISPR/Cas9. Por otro lado, algunos genes frecuentemente mutados en cáncer pueden servir no sólo como biomarcadores, sino también como dianas terapéuticas contra el cáncer, como ocurre con KRAS, el oncogén más frecuentemente mutado en LUAD. KRAS mutante ha sido hasta hace muy poco una diana elusiva, con tan solo dos fármacos dirigidos contra KRASG12C aprobados desde 2021: el sotorasib y el adagrasib. Sin embargo, estos fármacos se han enfrentado a diversas dificultades en los últimos ensayos clínicos, ya que la mayoría de los pacientes acababan desarrollando resistencias y sufriendo una recidiva en un periodo de un año. Por ello, se necesita seguir explorando nuevas estrategias terapéuticas contra tumores KRAS-mutantes, y la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 podría ser la solución. CRISPR/Cas9 puede de forma específica eliminar los alelos mutantes de un gen diana sin afectar a su versión silvestre no tumoral. Así, de forma altamente selectiva, se pueden eliminar las células tumorales que posean dicha mutación. En esta tesis se trató de optimizar el diseño y la entrega, y medir la especificidad y eficiencia de una nueva terapia molecular contra KRASG12C/G12D usando la tecnología CRISPR y una versión de alta fidelidad del enzima Cas9 (terapia CRISPR-KRAS). Tras comprobar la especificidad de los ARN guías diseñados, nuestra terapia CRISPR-KRAS consiguió reducir la viabilidad celular hasta alrededor de un 70% en líneas celulares de LUAD KRAS mutantes, sin afectar a las células KRAS silvestres. Por último, los mecanismos celulares por los cuales los tumores se vuelven resistentes a las terapias dirigidas contra oncogenes pueden estudiarse por medio de un cribado CRISPR (CRISPR-screening). Esta técnica nos permite conocer las dependencias colaterales que aparecen en las células supervivientes tras eliminar un determinado oncogén. Para aplicar esta tecnología puntera, realizamos un cribado CRISPR sobre clones “knockout” (KO) que habíamos generado previamente en el laboratorio para un oncogén (PKP1) en cáncer de pulmón epidermoide (LUSC). Tras el cribado, descubrimos que entre los genes más esenciales para los clones PKP1-KO se hallaban un gran número de genes implicados en la traducción y terminación de la transcripción mitocondriales, como MTERF4 y numerosas proteínas mitorribosomales. Esto abre una nueva línea de investigación para una futura co-terapia dirigida contra el LUSC, que involucraría un inhibidor de PKP1 junto con algún antibiótico inhibidor de la traducción mitocondrial, con el objetivo de aumentar su efecto y evitar la aparición de resistencias.