Estudio metabólico y genético de los mecanismos implicados en la tolerancia al frío durante la postcosecha del fruto de calabacín

Abstract

Cucurbita pepo es una especie nativa de América, aunque hoy en día es cultivada en todo el mundo, siendo una de las especies con mayor variabilidad en el reino vegetal. C. pepo morfotipo zucchini es uno de los cultivos hortícolas más importantes en España, siendo Andalucía la región con mayor producción. La mayor parte de esta producción es exportada a Europa para consumo en fresco, donde los consumidores demandan una calidad cada vez más alta, lo que hace que sea necesaria una conservación apropiada, durante el periodo postcosecha, para mantener la calidad del fruto hasta que llegue al consumidor. El fruto de calabacín es cosechado en un estadío inmaduro, por ello su metabolismo continúa siendo muy rápido, haciendo necesario almacenarlo a bajas temperaturas para reducir su tasa respiratoria y prevenir el deterioro del fruto. Sin embargo, debido a su origen subtropical, la conservación a bajas temperaturas puede inducir en el fruto un síndrome conocido como daños por frío “chilling injury” (CI), que aparece como resultado de numerosas alteraciones fisiológicas y bioquímicas. Estos daños por frío son los responsables de la pérdida de calidad en el fruto, causando unas pérdidas económicas severas. Para mejorar o mantener la calidad del fruto durante el almacenamiento en frío, hemos llevado a cabo estudios sobre tratamientos físicos y químicos que pueden mejorar la conservación del fruto tras la cosecha, con especial interés en tratamientos que pueden prevenir los daños por frío. El uso de cubiertas comestibles ha surgido como una respuesta a una demanda creciente de métodos que sean ecológicamente respetuosos con el medio ambiente para mantener la calidad del fruto durante el almacenamiento. De entre las diferentes cubiertas polisacarídicas estudiadas, la dextrina ha probado ser la más efectiva en el mantenimiento de la calidad postcosecha de calabacín durante el almacenamiento en frío. Posteriormente, para mejorar estos resultados, se testó la combinación de dextrina con oleuropeína y aceite de oliva, aditivos con función protectora y nutracéutica. Los resultados mostraron que las cubiertas de dextrina redujeron la pérdida de peso, los daños por frío, y el estrés oxidativo en fruto de calabacín almacenado a bajas temperaturas, manteniendo la calidad del fruto. Los aditivos naturales obtenidos del olivo provocaron una mayor inducción de enzimas antioxidantes, así como también una acumulación de ascorbato y fenoles totales, siendo la cubierta de dextrina con aceite de oliva la más efectiva frente al índice de daños por frío hasta el final del almacenamiento, asociado con el metabolismo fenólico. En un trabajo previo, se ha descrito que una variedad tolerante al frío de calabacín acumuló altas concentraciones de ácido abscísico (ABA) en los primeros días de almacenamiento en frío, por ello se decidió estudiar el efecto de la aplicación de ABA en el metabolismo del fruto de calabacín frente al estrés por frío. Se encontró que el ABA modula el metabolismo primario, induciendo la acumulación de algunos azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos, incluyendo fenilalanina, ácido glutámico y ácido γ- aminobutírico, siendo todas ellas moléculas involucradas en la tolerancia a las bajas temperaturas. La aplicación de ABA también incrementa la capacidad antioxidante del fruto de calabacín durante el almacenamiento a través de una acumulación de ascorbato, carotenoides y compuestos polifenólicos, activando además la producción de flavonoides en el primer día de exposición a bajas temperaturas, siendo clave esta acumulación de metabolitos antioxidantes para evitar la incidencia de daños por frío. Además, se pudo observar que el tratamiento con ABA activa la biosíntesis de t-zeatina y riboflavina durante los primeros días de almacenamiento en frío, por lo que estos metabolitos son candidatos de ser señales moleculares importantes en la respuesta al frío mediada por ABA para inducir tolerancia al frío en el fruto de calabacín, activando la defensa antioxidante a través de la ruta de fenilpropanoides. Además, una de las hipótesis es que el ABA podría regular la ruta fenilpropanoide induciendo la síntesis de riboflavina. Finalmente, para descifrar los mecanismos genéticos que subyacen a la tolerancia al frío, dos variedades contrastantes para este rasgo se cruzaron para generar una población segregante. El estudio de asociación del genoma completo (GWAS) permitió identificar 2 regiones implicadas en la tolerancia al frío (QTLs), una en el cromosoma 5 y otra en el 18. Investigando la anotación de los genes presentes en dichas regiones algunos de ellos se identificaron como candidatos para ser los responsables del fenotipo, involucrados principalmente en el mantenimiento de la cutícula, respuesta fitohormonal y síntesis de metabolitos relacionados con estrés, como el ácido siquímico o poliaminas. Este estudio permitió además determinar marcadores KASP para cada región de interés. En conclusión, el uso de cubiertas comestibles como dextrina, o la aplicación de tratamientos como ABA o riboflavina, mantienen la calidad postcosecha del fruto de calabacín durante su conservación a bajas temperaturas, haciendo factible el transporte y comercialización del fruto por las compañías hortofrutícolas. Además, los marcadores KASP diseñados para cada QTL pueden utilizarse en futuros programas de mejora, permitiendo el desarrollo de nuevas variedades de calabacín con mayor tolerancia al estrés por frío.

Cucurbita pepo is a native species of America, although nowadays it is cultivated worldwide and is one of the most variable species in the plant kingdom. C. pepo morphotype zucchini is specifically one of the most important horticultural crops in Spain, being Andalucía the region with the highest production in this commodity. Most of this production is exported to Europe for fresh consumption, where consumers increasingly demand an extra quality, which makes proper postharvest storage of the fruit necessary to maintain its quality until it reaches the consumer. Zucchini fruit is harvested in an immature state, so its metabolism is still very fast, making it necessary to store it at low temperatures to reduce its respiratory rate and to prevent fruit decay. However, due to its subtropical origin, the conservation at low temperature may induce in the fruit a syndrome known as chilling injury, that appears as a result of numerous physiological and biochemical alterations. These chilling injuries are responsible for a loss of quality in the fruit and cause serious economic losses. To improve or retain fruit quality during cold storage, we have undergone studies about physical and chemical treatments that can improve the conservation of the fruit after harvest, with special focus on treatments that can prevent chilling injuries. The use of edible coatings has surged as a response to the everincreasing demand for ecologically friendly methods for maintaining fruit quality during storage. Among the different polysaccharide-based coatings studied, dextrin has shown to be the most effective in maintaining the postharvest quality of zucchini fruit during cold storage. Subsequently, to improve these results, the nutraceutical additives oleuropein and olive oil, were tested in combination with dextrin. Results showed that dextrin coatings reduced weight loss, chilling injury, and oxidative stress in zucchini fruit stored at low temperature, maintaining fruit quality. The natural additives obtained from the olive tree showed a higher induction of antioxidant enzymes as well as a greater accumulation of ascorbate and total phenolics, with the dextrin coating with olive oil being even more effective in maintaining the chilling injury low until the end of storage, associated to phenolic metabolism. In a previous work, it has been described that a cold-tolerant zucchini variety accumulated high amounts of abscisic acid (ABA) in the first days of cold storage, so the effect of ABA application on the cold tolerance of zucchini fruit was studied using a metabolomic approach. It was found that ABA modulates the primary metabolism inducing the accumulation of some sugars, organic acids and amino acids including phenylalanine, glutamic acid and γ- aminobutyric acid, all of them molecules involved in low-temperature tolerance. The application of ABA also increases the antioxidant capacity of zucchini fruit during storage through the accumulation of ascorbate, carotenoids, and polyphenolic compounds, mainly activating the production of flavonoids during the first day of exposure to low temperatures, being this response key to avoiding the occurrence of chilling injury. It was also observed that ABA treatment activates the t-zeatin and riboflavin biosynthesis during the first days of cold storage, making these metabolites candidates to be important molecular signals in the ABA-mediated cold response to induce tolerance in zucchini fruit. To go deeper into the response to ABA, zucchini fruit were treated with exogenous riboflavin. This treatment also increased the cold tolerance of zucchini fruit, activating antioxidant defense through the phenylpropanoid pathway. Therefore, one of the hypotheses is that ABA could regulate the phenylpropanoid pathway inducing the synthesis of riboflavin. Finally, in order to unravel the genetic mechanisms underlying cold tolerance in zucchini fruit, two zucchini varieties with contrasting degree of chilling sensitivity were crossed to obtain a segregating population. The genome wide association analysis showed 2 quantitative trait loci (QTLs) involved in cold tolerance, one in chromosome 5 and the other in chromosome 18. Some of the annotated genes in these regions were identified as candidates to be responsible of cold tolerance in zucchini fruit, mainly involved in cuticle maintenance, phytohormone responses, and the synthesis of stress-related metabolites, such as shikimic acid or polyamines. This approach also allowed to determine KASP markers for each region of interest. In conclusion, the use of edible coatings such as dextrin, or the application of treatments like ABA or riboflavin, maintains the postharvest quality of zucchini fruit during its conservation at low temperatures, allowing the transport and marketing of the fruit by companies. Furthermore, KASP markers designed for each QTL can be used in future genetic improvement programs, allowing to develop new varieties of zucchini with greater tolerance to cold stress.