Desarrollo de células CAR-T fisiológicas e inducibles de 4ª generación con aplicación en inmunoterapia antitumoral

Abstract

La terapia con células T que expresan Receptores de Antígeno Quiméricos (CARs) ha demostrado resultados sin precedentes en el tratamiento de neoplasias hematológicas del linaje B refractarias o en recaída. Sin embargo, a pesar de su alta eficacia antitumoral, esta terapia no está exenta de efectos secundarios graves como la tormenta de citoquinas o la neurotoxicidad. Además, la falta de potencia y/o persistencia de las células CAR-T debido a una sobreexpresión del CAR y a la interacción con un fuerte microambiente tumoral inmunosupresor, conduce a recaídas frecuentes en el tratamiento de tumores líquidos y a una falta de eficacia en el tratamiento de tumores sólidos. Además, el proceso de manufactura de las células CAR-T presenta limitaciones que, sumadas a los efectos secundarios, indican la necesidad de mejorar la terapia CAR-T. En esta tesis doctoral, hemos trabajado en tres objetivos para superar estas limitaciones: Regulación endógena de la expresión génica. Eyquem y colaboradores demostraron (utilizando herramientas de edición genómica) que cuando un CAR αCD19 sigue una cinética similar a la del TCR tras el encuentro antigénico (internalización rápida tras la activación, y una posterior recuperación de niveles basales de expresión), las células CAR-T incrementaban su potencia antitumoral, mejorando las características del producto. Con el objetivo de llevar esto a cabo en un contexto de vectores lentivirales, nuestro grupo diseñó el promotor AW, un promotor sintético que permitió que el CAR siguiera una cinética TCR-like, lo que dotó a las células de características mejoradas. Sin embargo, debido a los bajos niveles de expresión del CAR obtenidos, en esta tesis diseñamos dos promotores sintéticos basados en B2M y CD4 con el objetivo de conseguir esta cinética, pero con mayores niveles de expresión. Comprobamos que el promotor B2M presentó una cinética similar a la del TCR con un gen reportero y una mayor intensidad de expresión, lo que lo convierte en un buen candidato para la expresión de CARs. Por otro lado, el promotor CD4 no presentó una cinética TCR-like, aunque observamos una expresión restringida a tejidos asociada a este promotor, lo que lo hace interesante para aplicaciones que requieran expresar genes de manera restringida a células CD4. Generación de TRUCKs inducibles para incrementar la potencia sin comprometer la seguridad. Con el objetivo de incrementar la potencia antitumoral de las células CAR-T, sin comprometer la seguridad de la terapia, utilizamos el sistema Lent-On-Plus (el único sistema de expresión inducible por doxiciclina libre de transactivadores) para controlar la expresión de IL-18 en células CAR-T antiCD19 (iTRUCK19.18). Generamos las células iTRUCK19.18, observando que la inducción de IL-18 permitió controlar la liberación de citoquinas proinflamatorias, así como el nivel de activación de las células T. Comprobamos, además, que las células iTRUCK19.18 controlaron la polarización de macrófagos primarios pro-tumorales (M2) hacia un fenotipo antitumoral (M1) de manera dependiente de doxiciclina. Esto se tradujo en un incremento de la actividad antitumoral de las células CAR-T, tanto in vitro como in vivo, en un modelo tumoral líquido y otro sólido de elevada agresividad: un modelo de linfoma de Burkitt y un modelo de adenocarcinoma pancreático. Finalmente, generamos células iTRUCK19.18 a partir de células T de paciente, y observamos que la liberación de IL-18 incrementó la eliminación de tumores primarios B. Hasta dónde llega nuestro conocimiento, las células iTRUCK19.18 son las primeras células CAR-T capaces de controlar la producción de IL-18 de manera exógena, y pueden suponer una alternativa a la aplicación de células CAR-T convencionales en pacientes con ciertas neoplasias malignas agresivas. Generación de células empaquetadoras de vectores lentivirales más eficientes. Con el objetivo obtener vectores lentivirales con un mayor título, algo fundamental en la manufactura de células CAR-T, generamos células empaquetadoras más resistentes a la apoptosis celular (la cual está asociada a la sobreexpresión de proteínas tóxicas, como el CAR). Para ello, utilizamos CRISPR-Cas9 para eliminar la expresión de los genes BAX y BAK, cruciales en el control de la apoptosis mitocondrial, en células HEK-293T, obteniendo células empaquetadoras más resistentes a la apoptosis, lo que derivó en un incremento de los títulos virales de dos CARs diferentes. Estas células representan una plataforma interesante para la producción de vectores o proteínas tóxicas y pueden mejorar la eficacia de la manufactura de las células CAR-T.