Generation of chondroinductive scaffolds with improved biomechanical properties and development of a bioreactor for cartilage tissue engineering

Abstract

Osteoarthritis (OA) is a sizeable socioeconomic condition mainly affecting articular cartilage, a tissue with limited self-healing potential and hence a suitable target for regenerative medicine and tissue engineering (TE). To date, non-effective therapies for cartilage injuries have been discovered. The most pressing requirement in cartilage tissue engineering (CTE) is the development of biomaterials capable of customizing the tissue's complicated extracellular matrix (ECM). Further, novel bioengineered medical devices that stimulate the ex vivo growth of biomimetic CTE scaffolds are required. Regenerative Medicine (RM) is the therapeutical approach that tries organ/tissue repair, replacement, or regeneration to restore decreased function caused by any cause, including congenital deficiencies, illness, trauma, or age. It employs several technology techniques that go beyond typical transplantation and replacement therapy. These methods may include but are not limited to soluble chemicals, gene therapy, stem cell transplantation, TE, and cell and tissue type reprogramming. Alternatively, TE is an interdisciplinary discipline that uses engineering and life science concepts to create biological replacements that restore, maintain, or improve tissue function. Using cell-based treatments (or CTE products) to regenerate and repair cartilage is not new; techniques like matrix-induced autologous chondrocyte implantation (MACI) and autologous chondrocyte implantation (ACI) have been employed in clinical settings for many years. Even recently, a promised alternative, Instant Mesenchymal Stem Cells (MSC) Product Accompanying Autologous Chondron Transplantation (IMPACT), has been experimented with in situ based on fibrin glue containing allogeneic MSCs. Although these methods present some efficacy; however, it is challenging to maintain the proper chondrocyte cell quantity and differentiation stage in vitro, and the integration of cells into the surrounding tissue is still subpar. In this sense, the main objective of this thesis has been to offer solutions to these drawbacks. So, the manuscript has been divided into three chapters. The first chapter examined how varied geometries and pore sizes (i.e., microstructure) affect the adhesion and proliferation of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells (IPFP-MSCs) in biofabricated 3D thermoplastic scaffolds. These studies used a novel biomaterial for CTE, 1,4-butanediol thermoplastic polyurethane (b-TPUe), and a standardized one (polycaprolactone, PCL). Cell adhesion, proliferation, and mechanical properties were found to alter depending on the form, porosity, and type of biomaterial used. Conclusively, b-TPUe scaffolds more closely mimicked cartilage dynamics, and that triangular geometry with 1.5 mm of fiber distance was the best-adapted morphology for CTE. In the second chapter, scaffolds of b-TPUe were functionalized using type I collagen and 1-pyrene butyric acid (PBA). After, they were seeded with IPFP-MSCs to verify the effectiveness of these methods in comparison with naive scaffolds. Alamar Blue and confocal tests show that PBA functionalized scaffolds enable superior cell adhesion and proliferation throughout the first 21 days, being cell proliferation and vitality lesser than type I collagen functionalization. Nonetheless, both methods increased the production of ECM and the presence of chondrogenic markers (Sox9, Col2a, and Acan). The third chapter demonstrates for the first time the chondrogenic evolution of functionalized 3D scaffolds made of b-TPUe in real-time in a bioreactor (BR) with low shear pressures. A combination of ultrasonic monitoring and cross-correlation allowed this issue. Applying the signals obtained by a finite element model (FEM) of elastic pulse wave propagation and the empirical signals made it possible to calculate the actual sound speed and density. Further, IPFP-MSCs were utilized as a cellular source for the functionalized b-TPUe- based 3D scaffold. Results showed how the BR induced chondrogenesis in comparison with static 3D cultures. Conclusively, the BR represented a valuable tool for generating considerable chondrogenesis in a controlled manner. In summary, a whole process has been developed that uses IPFP-MSCs and functionalized b-TPUe scaffold to generate viable CTE grafts destined for OA treatment. Our highest novelty relies on the absence of an external growth factor to induce chondrogenesis in our 3D scaffolds. Further, a novel system that accelerates the maturation of these grafts and measures the ECM synthesis in real-time has been developed and validated. Therefore, the efficiency of our methodology in terms of cell concentration and ECM production in a relatively short time should imply a possible accurate alternative for CTE.

La osteoartritis (OA) es una importante afección socioeconómica que afecta principalmente al cartílago articular, un tejido con un potencial de autocuración limitado y, por tanto, un objetivo adecuado para la medicina regenerativa y la ingeniería tisular (TE). Hasta la fecha, se han descubierto terapias poco eficaces para las lesiones del cartílago. El requisito más apremiante en ingeniería tisular del cartílago (CTE) es el desarrollo de biomateriales capaces de personalizar la complicada matriz extracelular (ECM) del tejido. Además, se necesitan nuevos dispositivos médicos de bioingeniería que estimulen el crecimiento ex vivo de andamiajes biomiméticos de ETC. La medicina regenerativa (RM) es el enfoque terapéutico que trata de reparar, sustituir o regenerar órganos/tejidos para restablecer las funciones disminuidas por cualquier causa, incluidas las deficiencias congénitas, las enfermedades, los traumatismos o la edad. Emplea varias técnicas que van más allá de la típica terapia de trasplante y sustitución. Estos métodos pueden incluir, entre otros, sustancias químicas solubles, terapia génica, trasplante de células madre, TE y reprogramación de tipos de células y tejidos. Por su parte, la TE es una disciplina interdisciplinar que utiliza conceptos de ingeniería y ciencias de la vida para crear sustitutos biológicos que restauren, mantengan o mejoren la función de los tejidos. El uso de tratamientos basados en células (o productos de CTE) para regenerar y reparar el cartílago no es nuevo; técnicas como la implantación de condrocitos autólogos inducida por matriz (MACI) y la implantación de condrocitos autólogos (ACI) se han empleado en entornos clínicos durante muchos años. Incluso recientemente, se ha experimentado con una alternativa prometedora, el producto instantáneo de células madre mesenquimales (MSC) que acompaña al trasplante autólogo de condrocitos (IMPACT), in situ a base de pegamento a base de fibrina, que contiene MSC alogénicas. Aunque estos métodos presentan cierta eficacia, resulta difícil mantener la cantidad adecuada de condrocitos y el estadio de diferenciación in vitro, y la integración de las células en el tejido circundante sigue siendo deficiente. En este sentido, el principal objetivo de esta tesis ha sido ofrecer soluciones a estos inconvenientes. Así, el manuscrito se ha dividido en tres capítulos. En el primer capítulo se examinó cómo las distintas geometrías y tamaños de poro (es decir, la microestructura) afectan a la adhesión y proliferación de células madre mesenquimales derivadas de la almohadilla de grasa infrapatelar (IPFP-MSCs) en andamios termoplásticos 3D biofabricados. En estos estudios se utilizó un biomaterial novedoso para CTE, el poliuretano termoplástico 1,4-butanodiol (b-TPUe), y otro estandarizado (policaprolactona, PCL). Se observó que la adhesión celular, la proliferación y las propiedades mecánicas variaban en función de la forma, la porosidad y el tipo de biomaterial utilizado. En conclusión, los andamios de b-TPUe imitaban mejor la dinámica del cartílago, y que la geometría triangular con 1,5 mm de distancia entre fibras era la morfología mejor adaptada para la ETC. En el segundo capítulo, los andamios de b-TPUe se funcionalizaron con colágeno de tipo I y ácido 1-pireno butírico (PBA). Después, se sembraron con IPFP-MSCs para verificar la eficacia de estos métodos en comparación con los andamios ingenuos. Las pruebas confocales y con azul de Alamar muestran que los andamios funcionalizados con PBA permiten una adhesión y proliferación celular superiores a lo largo de los primeros 21 días, siendo la proliferación y viabilidad celular menores que la funcionalización con colágeno tipo I. No obstante, ambos métodos aumentaron la producción de ECM y la presencia de marcadores condrogénicos (Sox9, Col2a y Acan). El tercer capítulo demuestra por primera vez la evolución condrogénica de andamios 3D funcionalizados de b-TPUe en tiempo real en un biorreactor (BR) con bajas presiones de cizallamiento. Una combinación de monitorización ultrasónica y correlación cruzada permitió esta cuestión. La aplicación de las señales obtenidas mediante un modelo de elementos finitos (FEM) de propagación de ondas de pulso elásticas y las señales empíricas permitió calcular la velocidad y la densidad reales del sonido. Además, se utilizaron IPFP-MSC como fuente celular para el andamio 3D funcionalizado basado en b-TPUe. Los resultados mostraron cómo el BR inducía la condrogénesis en comparación con los cultivos 3D estáticos. En conclusión, el BR representa una herramienta valiosa para generar una condrogénesis considerable de forma controlada. En resumen, se ha desarrollado un proceso completo que utiliza IPFP-MSCs y un andamio b-TPUe funcionalizado para generar injertos de CTE viables destinados al tratamiento de la OA. Nuestra mayor novedad radica en la ausencia de un factor de crecimiento externo para inducir la condrogénesis en nuestros andamios 3D. Además, se ha desarrollado y validado un novedoso sistema que acelera la maduración de estos injertos y mide la síntesis de ECM en tiempo real. Por lo tanto, la eficacia de nuestra metodología en términos de concentración celular y producción de ECM en un tiempo relativamente corto debería implicar una posible alternativa precisa para la CTE.