Narrow leafed lupin (Lupinus angustifolius L.) β-Conglutin proteins as new preventive, cytotoxic and radiosensitizing agents against breast cancer cells

Abstract

Breast cancer (BC) is the most widespread tumor in women and the second type of most common cancer worldwide. BC is characterized by an intra and inter-tumoural heterogeneity that, commonly, make this disease extremely intractable. In BC, the presence of a particular subpopulation of cancer stem cells (CSCs) is related to relapse, metastases, self-renewal capacity and radio-resistance. In this context, radiotherapy (RT) is one of the most used treatments for BC. Despite of that, it is not always effective and CSCs are partially responsible of RT resistance and failure. Ionizing radiation (IR) has also been associated with promotion of CSCs phenotype. In this context, the technical and medical advances in existing therapies in the last decade had not been able to overcome the fact that between 30 and 50% of patients with BC will develop metastasis, which contributes to the high mortality rates. This situation urges the need to find more effective prevention and treatment strategies like the use of plant-based nutraceutical compounds. In this context, considerable interest is focused on legume seed proteins, mainly those from genus Lupinus, and particularly from the “Sweet lupin” group.Lupin is a legume belonging to the Fabaceae family. Interestingly, the seeds of Narrow-leafed lupin (NLL) or Lupinus angostifolius L. or blue lupin are attracting attention because of their potential use for inflammatory related diseases prevention and improvement. Vicilin family of proteins, and particularly β-conglutin proteins are the most abundant proteins in all lupin species including NLL. Recently, the anti-diabetic, antioxidant, and anti-inflammatory properties of β-conglutins were described, on this basis they were proposed as new potential functional foods with therapeutic and preventive properties in inflammatory-related diseases like BC. The main goal of the present doctoral thesis is to assess whether those promising nutraceutical compounds could be natural preventive and cytotoxic agents for BC cell lines with a radiosensitizing effect on advanced malignant cells, mediated by the implication of CSCs related genes and mechanisms. On the other hand, this thesis also studied and identified the structural domain β-conglutins having key importance in the nutraceutical properties of those NLL seed compounds. To achieve it, we purified different isoforms of NLL β-conglutins using affinity-chromatography. We analyzed their structural modelling and studied two previously uncharacterized β-conglutin isoforms, β5 and β7, in order to assess their inflammatory amelioration properties using in vitro cell model, and ex vivo cell systems such as type 2 diabetes (T2D) cells compared with and healthy control cells. Since inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines, iNOS expression and nitric oxide (NO) production, and regulate the antioxidant capacity of cells, β5 and β7 are newly discovered anti-inflammatory proteins. We also demonstrated, that mobile arm structural domain of β5 and β7 is involved in nutraceutical properties as compared to truncated forms, applying these features for all NLL β-conglutin protein isoforms since other functional isoform have the same behavior. Then, we used the previously more in-deep studied β-conglutins 1, 3 and 6 to evaluate their effectiveness in terms of viability, proliferation, apoptosis, stemness properties, and mechanism of action on two different models of BC cell lines and a healthy one: an early BC model and an advanced one. NLL β-conglutins can become a preventive agent of great interest in early stages of BC, regulating the bone morphogenetic pathway (BMP) and preventing malignant transformation and epithelial to mesenchymal (EMT) enhancement in healthy cells. Those proteins can also be an interesting cytotoxic, natural and anti-stem-cell-like properties treatment for both early and advanced BC models, from very low concentrations and preserving the viability of healthy cells. These proteins could act through a regulation of BMP related genes and a dual mechanism involving tumorigenic and stemness-related genes such as SIRT1 and FoxO1, depending on the state of p53. NLL β-conglutin proteins have also a radiosensitizing potential in combination with conventional RT. The combined therapy of β-conglutins and IR showed lower survival fraction, higher apoptotic rates and lower DNA damage response (DDR) in all BC cell lines, especially in the most aggressive phenotype, MDA-MB-231. This combined therapy also regulated and decreased CSCs subpopulation as well as self-renewal capacity, assuring the highest effectiveness of radiation and the prevention of the CSCs phenotype acquisition, at the origin of tumor regrowth, metastasis and relapse. In conclusion, based in this PhD Thesis results and for the best of our knowledge, this is the first time that these NLL β-conglutin proteins have been identifies as potentially anti-BC, with the capability of being used for BC management, making them a unique and novel strategy for the BC treatment at different stages and from multiple perspectives: i) prevention of the disease, ii) treatment in early and advanced cases, iii) sensitizing for radiotherapy and prevention of metastasis and relapse. More studies must be carried out to completely understand the underlying mechanisms of action of these nutraceutical compounds in BC in vitro and in vivo systems, and their potential use for the inhibition of other cancer cell types as well.

El cáncer de mama (CM) es el tumor más extendido en la mujer y el segundo tipo de cáncer más común a nivel mundial. El CM se caracteriza por una heterogeneidad intra e intertumoral que, comúnmente, hace que esta enfermedad sea extremadamente intratable. En el CM, la presencia de una subpoblación particular de células madre cancerosas (CMC) está relacionada con recidivas, metástasis, capacidad de auto-renovación y radio-resistencia. En este contexto, la radioterapia (RT) es uno de los tratamientos más utilizados para el CM. A pesar de esllo no siempre es efectiva y las CMC son parcialmente responsables de la resistencia a la RT. La radiación ionizante (RI) también se ha asociado con la promoción del fenotipo de CMC. En este contexto, los avances técnicos y médicos en las terapias existentes en la última década no han podido impedir que entre el 30 y el 50% de los pacientes con CM desarrollaran metástasis, lo que contribuye a las altas tasas de mortalidad. Esta situación apremia la necesidad de encontrar estrategias de prevención y tratamiento más efectivas como el uso de compuestos nutracéuticos de origen vegetal. En este contexto, se centra un gran interés en las proteínas de semillas de leguminosas, principalmente las del género Lupinus, y en particular del grupo “Sweet lupin”. El lupino es una leguminosa perteneciente a la familia Fabaceae. Curiosamente, las semillas de lupino de hoja estrecha (NLL) o Lupinus angostifolius L. o lupino azul están atrayendo la atención debido a su uso para la prevención y mejora de enfermedades relacionadas con la inflamación. La familia de proteínas “vicilinas”, y particularmente las proteínas β-conglutinas, son las proteínas más abundantes en todas las especies de lupino, incluida la NLL. Recientemente, se han descrito las propiedades antidiabéticas, antioxidantes y antiinflamatorias de las β-conglutinas y, en base a esto, se han propuesto como nuevos alimentos funcionales con propiedades terapéuticas y preventivas en enfermedades relacionadas con la inflamación como el CM. El principal objetivo de la presente tesis doctoral es evaluar si estos prometedores compuestos nutracéuticos podrían ser agentes preventivos y citotóxicos naturales para líneas celulares de CM con un efecto radiosensibilizador sobre células malignas avanzadas, mediado por la implicación de genes y mecanismos relacionados con las CMC. Por otro lado, esta tesis también estudió e identificó el dominio estructural de las β-conglutinas que tienen una importancia clave en las propiedades nutracéuticas de estos compuestos de semillas NLL. Para lograrlo, purificamos diferentes isoformas de β-conglutinas de NLL mediante cromatografía de afinidad. Analizamos su modelado estructural y estudiamos dos isoformas de β-conglutina previamente no caracterizadas, β5 y β7, para evaluar sus propiedades de mejora inflamatoria utilizando un modelo celular in vitro y sistemas celulares ex vivo como las células de diabetes tipo 2 (T2D) en comparación con y células de control sanas. Dado que inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias, la expresión de iNOS y la producción de óxido nítrico (NO), y regulan la capacidad antioxidante de las células, β5 y β7 son proteínas antiinflamatorias recientemente descubiertas. También demostramos que el dominio estructural del brazo móvil de β5 y β7 está involucrado en las propiedades nutracéuticas en comparación con las formas truncadas, aplicando estas características para todas las isoformas de proteína β-conglutinas NLL ya que otras isoformas funcionales tienen el mismo comportamiento. A continuación, utilizamos las β-conglutinas 1, 3 y 6, estudiadas previamente más en profundidad, para evaluar su efectividad en términos de viabilidad, proliferación, apoptosis, propiedades relacionadas con el fenotipo de CMC y mecanismo de acción en dos modelos diferentes de líneas celulares de CM y uno saludable: un modelo de CM de estadios tempranos y uno de CM avanzado. Las β-conglutinas de NLL pueden convertirse en un agente preventivo de gran interés en estadios tempranos de CM, regulando la vía de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y previniendo la transformación maligna y el aumento de transición epitelio-mesénquima (TME) en células sanas. Esas proteínas también pueden ser un interesante tratamiento citotóxico, natural y con propiedades anti-células madre cancerosas para modelos de CM tanto tempranos como avanzados, desde concentraciones muy bajas y preservando la viabilidad de las células sanas. Estas proteínas podrían actuar a través de una regulación de genes relacionados con las BMP y un mecanismo dual que involucra genes relacionados con tumorigénesis y propiedades anti-CMC como SIRT1 y FoxO1, dependiendo del estado de p53. Las proteínas β-conglutinas de NLL también tienen un potencial radiosensibilizador en combinación con la RT convencional. La terapia combinada de β-conglutinas y RI mostró una fracción de supervivencia más baja, tasas de apoptosis más altas y una respuesta al daño del ADN más baja en todas las líneas celulares de CM, especialmente en el fenotipo más agresivo, MDA-MB-231. Esta terapia combinada también reguló y disminuyó la subpoblación de CMC, así como la capacidad de auto-renovación, asegurando la mayor efectividad de la radiación y la prevención de la adquisición del fenotipo de CSC, en el origen del crecimiento tumoral, la metástasis y la recaída. En conclusión, en base a los resultados de esta tesis doctoral y según nuestro mejor conocimiento, esta es la primera vez que estas proteínas β-conglutinas de NLL se identifican como potencialmente anti-CM, con la capacidad de ser utilizadas para el manejo de la enfermedad, convirtiéndose en una estrategia única y novedosa para el tratamiento del CM en diferentes etapas y desde múltiples perspectivas: i) prevención de la enfermedad, ii) tratamiento en casos tempranos y avanzados, iii) sensibilización para radioterapia y prevención de metástasis y recidivas. Se deben realizar más estudios para comprender completamente los mecanismos de acción subyacentes de estos compuestos nutracéuticos en los sistemas in vitro e in vivo de CM, y su uso potencial para la inhibición de otros tipos de células cancerosas también.