Acción de los polifenoles del aceite de oliva en la regeneración epitelial

Abstract

Las heridas crónicas son lesiones de la piel que tienen una evolución tórpida y prolongada en el tiempo, debido fundamentalmente a una alteración en el proceso de cicatrización. Aunque las causas que originan la cronificación son diversas, destacan la presencia de carga bacteriana en la herida y un proceso inflamatorio prolongado en el tiempo, que conduce a la interrupción de la migración y proliferación de fibroblastos, una población especialmente implicada en el mantenimiento de la integridad y homeostasis tisular, fundamental en la reparación de los tejidos. Actualmente no existe un tratamiento totalmente efectivo en el manejo de este tipo de lesiones, por lo que la búsqueda de nuevas herramientas terapéuticas innovadoras y eficaces, se ha convertido en una prioridad clínica. En este sentido, los compuestos bioactivos de origen vegetal están ganado interés en el campo de la biomedicina por su potencial beneficio para la salud. Así, diversos compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen extra (AOVE) como el hidroxitirosol (htyr), tirosol (tyr) y oleocantal (ole), presentes en gran concentración en los productos de desecho del mismo, poseen propiedades regenerativas, antiinflamatorias, antioxidantes, lo que los convierte en una alternativa útil en el abordaje terapéutico de las lesiones de la piel. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis doctoral fue analizar el efecto de distintos compuestos fenólicos (htyr, tyr y ole) presentes en el AOVE sobre la fisiología del fibroblasto. Para la consecución de este objetivo, se llevó a cabo un modelo de cicatrización in vitro, usando fibroblastos humanos (CCD-1064Sk) que fueron tratados con htyr, tyr y ole a distintas concentraciones. En esta población se estudió el efecto de estos fitoquímicos sobre el crecimiento y migración celular mediante espectrofotometría y el método del insert de cultivo, el perfil antigénico con microscopía confocal y citometría de flujo, así como la expresión génica mediante PCR en tiempo real. Además, se evaluó el efecto de htyr, tyr y ole sobre la capacidad funcional del fibroblasto en un modelo de herida inflamada. Para ello, la acción de dichos compuestos sobre la proliferación y migración celular fue analizada en un ambiente proinflamatorio inducido con LPS. Posteriormente, los niveles de interleuquina IL-1b fueron analizados con la técnica ELISA. También, se recreó un ambiente proinflamatorio utilizando un medio suplementado con las interleuquinas IL-6, IL-1b y TNF-a. Igualmente, se determinó el efecto antimicrobiano de estos compuestos frente a Candida albicans, Staphylococcus aureus and Pseudomona aeuroginosa, utilizando la técnica de difusión en disco. Todos los datos fueron analizados con el software estadístico SPSS. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran cómo la proliferación celular aumentó significativamente con el tratamiento de todos los compuestos. Los mayores aumentos se produjeron tras los tratamientos con htyr o tyr a dosis de 10-5 o 10-6 M y con ole a 10-6 y 10-7M, y estos compuestos y dosis se utilizaron para ensayos de perfil antigénico, ciclo celular y migración. Durante las primeras horas tras el tratamiento, se observó un aumento de las expresiones de fibronectina y α-actina y una mayor migración celular, sin que se produjeran cambios en el ciclo celular. Por otro lado, tras 24 h de tratamiento con htyr se observó un aumento de la expresión del factor de crecimiento del tejido conjuntivo, el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento endotelial vascular, el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) y sus receptores. Por su parte, tyr y ole modularon la expresión del FGF y el TGF-βR1. Todos los fitoquímicos probados modificaron la expresión de marcadores de diferenciación y elementos de la matriz extracelular, aumentando la expresión génica de actina, fibronectina, decorina, colágeno I y III. Por último, en el contexto de un modelo de herida inflamada los compuestos fenólicos analizados redujeron los niveles de IL-1b derivados de un proceso inflamatorio inducido por LPS, además de conservar la viabilidad celular de fibroblastos en este ambiente inflamado. Del mismo modo, mostraron capacidad para promover la proliferación y migración de fibroblastos humanos expuestos al estrés inflamatorio inducido por citoquinas pro-inflamatorias. Si bien, no se observó actividad antimicrobiana a las dosis ensayadas. En conjunto, los resultados de esta tesis doctoral sugieren que los compuestos fenólicos del AOVE poseen propiedades que pueden impactar positivamente en el tratamiento terapéutico de las heridas. Esto se logra mediante la estimulación celular y la modulación de la respuesta inflamatoria, lo que abre nuevas perspectivas en el campo de la investigación clínica.

Chronic wounds are skin lesions that have a torpid and prolonged evolution over time, mainly due to an alteration in the healing process. Although the causes of chronification are diverse, the most important are the presence of bacterial load in the wound and a prolonged inflammatory process that leads to the interruption of migration and proliferation of fibroblasts, a population particularly involved in the maintenance of tissue integrity and homeostasis, which is essential for tissue repair. There is currently no fully effective treatment for the management of this type of lesion, so the search for new, innovative and effective therapeutic tools has become a clinical priority. In this regard, bioactive compounds of plant origin are gaining interest in the field of biomedicine for their potential health benefits. Thus, various phenolic compounds in extra virgin olive oil (EVOO) such as hydroxytyrosol (htyr), tyrosol (tyr) and oleocanthal (ole), present in high concentration in the waste products of the oil, possess regenerative, anti-inflammatory and antioxidant properties, which make them a useful alternative in the therapeutic approach to skin lesions. Therefore, the main objective of this doctoral thesis was to analyse the effect of different phenolic compounds (htyr, tyr and ole) present in EVOO on fibroblast physiology. To achieve this objective, an in vitro healing model was carried out using human fibroblasts (CCD-1064Sk) that were treated with htyr, tyr and ole at different concentrations. In this population, the effect of these phytochemicals on cell growth was studied by spectrophotometry and migration using the culture insert method, antigenic profiling with confocal microscopy and flow cytometry, as well as gene expression by real-time PCR. Furthermore, the effect of htyr, tyr and ole on the functional capacity of fibroblasts was evaluated in an inflamed wound model. For this purpose, the action of these compounds on cell proliferation and migration was analysed in a proinflammatory environment induced with LPS. Subsequently, interleukin IL-1b levels were analysed by ELISA. Also, a proinflammatory environment was recreated using a medium supplemented with the interleukins IL- 6, IL-1b and TNF-a. The antimicrobial effect of these compounds against Candida albicans, Staphylococcus aureus and Pseudomona aeuroginosa was also determined using the disc diffusion technique. All data were analysed with SPSS statistical software. The results obtained in this doctoral thesis show that cell proliferation increased significantly with treatment with all compounds. The greatest increases occurred after treatment with htyr or tyr at doses of 10-5 or 10-6 M and with ole at 10-6 and 10-7M, and these compounds and doses were used for antigenic profiling, cell cycle and migration assays. During the first hours after treatment, increased fibronectin and α-actin expressions and increased cell migration were observed, with no changes in cell cycle. On the other hand, after 24 h of htyr treatment, increased expression of connective tissue growth factor, fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor β1 (TGF-β1) and their receptors was observed. In turn, tyr and ole modulated the expression of FGF and TGF-βR1. All the phytochemicals tested modified the expression of differentiation markers and extracellular matrix elements, increasing gene expression of actin, fibronectin, decorin, collagen I and III. Finally, in the context of an inflamed wound model, the phenolic compounds analysed reduced the levels of IL-1b derived from an LPS-induced inflammatory process, as well as preserving fibroblast cell viability in this inflamed environment. Similarly, they showed the ability to promote the proliferation and migration of human fibroblasts exposed to inflammatory stress induced by pro-inflammatory cytokines. However, no antimicrobial activity was observed at the doses tested. Overall, the results of this doctoral thesis suggest that the phenolic compounds in EVOO possess properties that can have a positive impact on the therapeutic treatment of wounds. This is achieved through cell stimulation and modulation of the inflammatory response, which opens up new perspectives in the field of clinical research.