Exploring the production, biological activity and preclinical safety of antimicrobial spirotetronates isolated from marine microorganisms

Abstract

Históricamente, los productos naturales (PN) han desempeñado un papel fundamental en el descubrimiento de antibióticos. Ofrecen características especiales en comparación con los compuestos sintéticos, lo que conlleva tanto ventajas como retos para el proceso de descubrimiento de fármacos. En los últimos años, los nuevos avances tecnológicos y científicos han reforzado el campo del descubrimiento de productos naturales y de nuevos antibióticos, con el objetivo de contribuir a la lucha contra la Resistencia Antimicrobiana (RAM). El medio marino alberga un tesoro de compuestos bioactivos y los actinomicetos marinos han demostrado ser uno de los productores más prolíficos. La clase de los policétidos espirotetronatos, con más de 100 compuestos bioactivos descritos hasta la fecha, ha crecido recientemente con el descubrimiento de las phocoenamicinas, compuestos derivados de actinomicetos marinos que poseen diferentes actividades antibióticas y de los que se han descubierto inicialmente tres compuestos, la phocoenamicina y las phocoenamicinas B y C. Explorando la colección de cepas de MEDINA en busca de posibles nuevos productores de phocoenamicinas, se identificaron 27 cepas de actinomicetos, entre ellas 3 de origen marino y 24 terrestres, y su identificación taxonómica mediante secuenciación del ADNr 16S mostró que todas pertenecen al género Micromonospora, lo que sugiere que la biosíntesis de las phocoenamicinas está restringida a microorganismos de este género. A pesar de la estrecha relación taxonómica de las cepas, los productores identificados fueron aislados de ecosistemas muy diversos y de una amplia distribución geográfica. Utilizando el método de "una cepa, muchos compuestos" (OSMAC por sus siglas en inglés), estas 27 cepas se cultivaron en 10 medios diferentes cada una, lo que dio lugar a 270 fermentaciones, cuyos extractos crudos se analizaron por LC-HRMS y se ensayaron contra un panel de patógenos y mostraron actividad contra Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Mycobacterium tuberculosis H37Ra y Mycobacterium bovis, revelando un rico potencial antimicrobiano dentro de las 27 cepas. El análisis metabolómico mostró que las 27 cepas producían las tres phocoenamicinas conocidas, en al menos uno de los medios de cultivo y el análisis de la producción de estas phocoenamicinas determinó los medios de cultivo más adecuados. Se estudió la influencia de los diferentes parámetros de cultivo en el perfil químico obtenido y sólo las variaciones en el medio de cultivo pudieron explicar la variación química y determinar un cambio significativo en el perfil metabólico de las diferentes cepas de Micromonospora. La combinación del análisis LC-UV-HRMS, el perfil metabolómico y la creación de redes moleculares permitió la desreplicación putativa de los principales compuestos producidos por las 27 cepas en las diferentes condiciones de cultivo, que se dividieron en tres grupos principales, espirotetronatos, sideróforos y varios otros compuestos. También se identificó provisionalmente el espirotetronato maklamicina, estructuralmente relacionado con las phocoenamicinas, producido por las 27 cepas, y su coexistencia con las phocoenamicinas en los extractos confirmó el evidente origen biosintético común de ambas familias de compuestos. Además, los análisis revelaron provisionalmente la presencia de varios compuestos estructuralmente relacionados no revelados anteriormente y, por tanto, candidatos para el aislamiento y el descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos. Este perfil metabólico amplio y químicamente diverso de estas cepas puso de manifiesto la necesidad de seguir investigando. La combinación de estos análisis demostró ser una forma rápida y eficaz de priorizar las cepas. Aunque no se confirmaron las afirmaciones anteriores en la literatura sobre la producción de phocoenamicinas sólo en entornos marinos únicos, las especies de Micromonospora de origen marino fueron identificadas como las mejores productoras de phocoenamicinas, tanto por la abundancia en sus extractos de algunos de los principales miembros, como por la variedad de estructuras moleculares producidas. La exploración del crecimiento de Micromonospora y la producción de phocoenamicinas, sugirió las mejores condiciones de cultivo para la producción de los tres compuestos. Como resultado, se escalaron los cultivos de las tres cepas de Micromonospora de origen marino (CA- 214671, CA-214658 y CA-218877) (fermentaciones de 3 y 5 L) y se determinaron las condiciones cromatográficas óptimas para la purificación de las phocoenamicinas, lo que condujo al aislamiento y elucidación estructural de siete compuestos, entre ellos dos nuevas phocoenamicinas, las phocoenamicinas D y E, junto con las phocoenamicinas conocidas, las phocoenamicinas B y C, así como la maklamicina y el nuevo análogo 29-deoximaklamicina, descrito por primera vez como producto natural, y para el que se ha propuesto el nombre de maklamicina B. Las dos familias de compuestos compartían múltiples características estructurales, así como variaciones estructurales comunes que se pusieron de relieve. Curiosamente, una de las nuevas phocoenamicinas descritas presentaba la misma cadena lateral de la maklamicina, única hasta la fecha en este compuesto, lo que indicaba una funcionalidad conservada en las dos familias. Todos los compuestos aislados se ensayaron contra un panel de patógenos humanos bacterianos, entre ellos S. aureus resistente a la meticilina (SARM), M. tuberculosis H37Ra, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis y Neisseria gonorrhoeae. Al igual que otros espirotetronatos relacionados, la mayoría de los compuestos mostraron cierta actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas y los ensayos antibacterianos revelaron algunas relaciones estructura-actividad. En general, los compuestos más activos fueron maklamicina B y maklamicina, seguidos de phocoenamicina y phocoenamicina B, siendo algunas de estas actividades notificadas por primera vez. Los compuestos demostraron una citotoxicidad débil o nula frente a la línea celular de adenocarcinoma hepático humano (Hep G2). Por último, se evaluó la toxicidad de los tres compuestos principales obtenidos, a saber, phocoenamicina, phocoenamicina B y maklamicina, frente a embriones de pez cebra eleuthero y no se observó toxicidad hasta la concentración más alta ensayada (25 μM). La maklamicina B resultó ser el compuesto más interesante, ya que combinaba una fuerte actividad antimicrobiana frente a MRSA, M. tuberculosis y E. faecium con la ausencia de citotoxicidad. Los nuevos análogos aislados pusieron de manifiesto la amplia gama de diversidades estructurales de los espirotetronatos y las posibles relaciones estructura-actividad aquí registradas, junto con otras comunicadas anteriormente dentro de la clase de los espirotetronatos, pueden utilizarse como piezas de un rompecabezas para desvelar el potencial biosintético de estos compuestos.