Implicaciones metabólicas y genómicas de las enzimas HD82 y endonucleasa V en Trypanosoma brucei

Abstract

La tripanosomiasis humana africana, comúnmente conocida como enfermedad del sueño, es causada por el parásito protozoario Trypanosoma brucei, perteneciente a la clase Kinetoplástida. Esta enfermedad, endémica en 36 países del África subsahariana, es transmitida por la picadura de la mosca tse-tsé (Glossina spp.), actuando como vector entre hospedadores mamíferos. A pesar de que las iniciativas de control y vigilancia han logrado reducir significativamente el número de casos nuevos a cifras históricamente bajas, con 837 casos reportados en 2022 (OMS), la enfermedad sigue representando un desafío significativo debido a la limitada disponibilidad de tratamientos, que son en su mayoría tóxicos y propensos a generar resistencias (Langousis & Hill, 2014). La homeostasis del pool de dNTPs es crucial para la preservación de la integridad genómica, jugando un papel esencial en los procesos de replicación y reparación del DNA. Desequilibrios en este pool pueden desencadenar eventos de genotoxicidad, mutagénesis, y tumorogénesis (Meuth, 1989, Kunz et al., 1994, Kohnken et al., 2015), resaltando la importancia del metabolismo de nucleótidos como fuente de dianas terapéuticas. En este contexto, el metabolismo de pirimidinas en T. brucei adquiere especial relevancia, dado que este parásito carece de las enzimas necesarias para la síntesis de novo de purinas, pero es capaz de sintetizar nucleótidos de pirimidina mediante ambas vías, la de recuperación de nucleósidos del medio celular y extracelular y la síntesis de novo (Hammond & Gutteridge, 1984). Aunque esta aparente redundancia metabólica sugiere una ventaja adaptativa, algunas enzimas implicadas en la biosíntesis de novo son esenciales para la viabilidad del parásito (Valente et al., 2016) (Castillo-Acosta et al., 2013) (Yagüe-Capilla et al., 2021) destacando su potencial como dianas para el desarrollo de nuevos fármacos antiparasitarios. La caracterización de las dNTPasas de T. brucei emerge como una necesidad dentro de la investigación antiparasitaria, considerando su posible papel en la regulación de los niveles intracelulares de nucleótidos. En el laboratorio se han identificado dos nucleotidasas que forman parte del genoma de T. brucei, las cuales contienen un dominio histidine-aspartic acid (HD), por lo que se denominaron TbHD82 y TbHD52. Ambas son altamente similares a la proteína humana sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1), una trifosfato desoxinucleósido hidrolasa (dNTPasa) cuya principal función es mantener una correcta homeostasis de los dNTPs (Yagüe-Capilla et al., 2021). El desarrollo de esta tesis ha ido encaminado a profundizar en la caracterización de TbHD82 y esclarecer su posible papel en la regulación de la homeostasis de dNTPs. El estudio de la localización intracelular de TbHD82 revela que es una enzima nuclear cuya expresión se regula a lo largo del ciclo celular, mostrando una mayor expresión durante la fase S temprana. La generación de líneas knockout y knockout condicionales tanto en la forma sanguínea del parásito como en la procíclica permitió confirmar que TbHD82 no es esencial para la viabilidad del parásito, aunque su ausencia tiene un impacto moderado en la tasa de proliferación. Las líneas deficientes en TbHD82 presentan defectos en la progresión del ciclo celular y un análisis detallado mediante marcaje con EdU evidenció un acortamiento de la fase S. La determinación del pool de dNTPs en las líneas deficientes en TbHD82, demostró la acumulación de dATP, dCTP y dTTP tanto en la forma sanguínea como procíclica, mientras que en las líneas que sobreexpresan TbHD82 se produjo una reducción general significativa de los niveles de dNTPs. El desequilibrio de dNTPs resultante en las células knockout está asociado a un fenotipo hipermutador, un aumento de la respuesta a daño en el DNA, la aparición de defectos en la horquilla de replicación, tales como una mayor velocidad e inestabilidad, y una menor infectividad en ratones. Además, es muy probable que TbHD82 participe en procesos relacionados con la recuperación y reparación de daño en el DNA, ya que se ve sobreexpresada tras la exposición de la forma sanguínea a DXR y DETA-NO, y las células deficientes en TbHD82 exhiben una menor eficiencia de recuperación al daño por DXR. Todo ello sugiere que TbHD82 tiene un papel central en la regulación del pool de dNTPs, impidiendo que alcancen niveles que dificulten la acción de la maquinaria de replicación y reparación. Por tanto, TbHD82 actuaría como un guardián de la fidelidad genómica modulando la acumulación excesiva y nociva de dNTPs en el núcleo. Por otro lado, a pesar de la estricta regulación de los niveles de dNTPs, en el DNA se producen constantemente lesiones derivadas del metabolismo endógeno o de agentes externos, los cuales pueden causar importantes daños como mutaciones o fragmentación. Un ejemplo de estos agentes genotóxicos son las especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (NOS), que pueden ser producidas tanto endógenamente por la célula como exógenamente durante la respuesta inmune del mamífero hospedador. Al ser un parásito extracelular y completar su ciclo de vida íntegramente dentro de un organismo, ya sea vector u hospedador, T. brucei está permanentemente expuesto a estas condiciones hostiles, lo que subraya la importancia del estudio de enzimas que mantienen la integridad genómica en estos protozoos. Una de las enzimas identificada en organismos procariotas por participar en la reparación de daño en el DNA es la endonucleasa V (EndoV), la cual hidroliza sustratos con inosina. La inosina es un nucleótido derivado de hipoxantina, una base nitrogenada no canónica, producto de la desaminación de la adenina tanto por desaminación espontánea como por acción de enzimas desaminasas. En organismos eucariotas, donde su función biológica exacta aún se desconoce, EndoV presenta una localización predominantemente citoplasmática y muestra preferencia por sustratos de RNA en ensayos in vitro (Morita et al., 2013, Nawaz et al., 2016a). La EndoV de T. brucei comparte dichas características, y ha demostrado ser además esencial para la forma procíclica del parásito (García-Caballero et al., 2017). Su actividad endoribonucleasa y el hecho de que se relocalice en gránulos de estrés durante periodos de privación nutricional sugiere que ésta tiene un papel relacionado con el control del pool de moléculas de RNA (ya sea tRNA o mRNA) con inosina mediante su degradación. El papel de los fragmentos derivados de la degradación de RNAs con inosina está aún en debate, pero es posible que estén implicados en la regulación de la transcripción y de la síntesis proteica (Thompson & Parker, 2009, Dhahbi, 2015). El trabajo realizado en esta tesis ha demostrado que tanto la forma nativa de TbEndoV como una forma mutante D95A, catalíticamente inactiva, se unen in vivo a RNA, aunque no se ha identificado su sustrato específico. Ensayos in vitro mostraron que el mutante catalítico es capaz de unirse a un sustrato de RNA que emula un tRNA desaminado, pero no de hidrolizarlo. Formas procíclicas mutantes dominante negativas que sobreexpresan el mutante catalítico presentan defectos en el crecimiento y alteraciones en la progresión del ciclo celular. Adicionalmente, la sobreexpresión del mutante catalítico en la forma procíclica, genera defectos en la integridad genómica tales como el aumento de la tasa de mutación, la formación de DSBs y la activación de la respuesta a daño en DNA. Finalmente, la sobreexpresión de TbEndoV-D95A en formas procíclicas da lugar a alteraciones a gran escala en la transcripción génica y a un aumento de la expresión de genes subteloméricos, fenómeno que podría estar relacionado con la activación de procesos de recombinación homóloga y variación antigénica como consecuencia de la inestabilidad genómica.