Diagnóstico serológico en pacientes tras infección por SARS-CoV-2. Estudio de neutralización en profesionales sanitarios tras vacunación

Abstract

Desde diciembre de 2019 el mundo ha vivido una situación sin precedentes en la historia reciente. Desde China, se propagó un virus hasta el momento desconocido. Gracias a la secuenciación de su genoma, pronto se pudo relacionar con la familia de los coronavirus y recibió el nombre de SARS-CoV-2, y la enfermedad que producía, COVID-19. Causó una pandemia con graves consecuencias para la economía y la salud en todo el mundo. Durante ese tiempo, se han destinado cuantiosos recursos, no solo al diagnóstico de la población y al tratamiento de los enfermos, sino también a recoger la mayor información posible sobre el virus para poder combatirlo. Con el fin de frenar la expansión, se ha reforzado la producción de medicamentos contra la enfermedad, personal sanitario cualificado y el desarrollo en un tiempo récord de vacunas efectivas y con tecnologías aprobadas por primera vez en la historia, como las vacunas de ARN mensajero. El objetivo de esta tesis es recoger la información más relevante sobre el SARS-CoV-2 y la COVID-19 y dar a conocer los resultados obtenidos en los estudios llevados a cabo en el Hospital Universitario Clínico San Cecilio de Granada (España) sobre la inmunidad humoral inducida por el virus. En el primer capítulo, se caracterizó la producción de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 a través de muestras de suero en 1.236 pacientes ingresados por COVID-19 y con infección por SARS-CoV-2 confirmada por RT-PCR entre abril y julio de 2020 (primera ola en España) en 18 centros de España y se determinó su producción en función de la edad y el sexo. La determinación de anticuerpos IgM + IgA e IgG se realizó por técnicas de ELISA y demostró que IgM + IgA tenían mayor reactividad que IgG al inicio de la enfermedad y hasta 16 días después, siendo estadísticamente significativa un día después del ingreso. La aparición de IgG se hizo presente a partir del séptimo día tras el resultado positivo de la PCR y continuó aumentando hasta las tres semanas, cuando IgM + IgA e IgG alcanzaron valores similares, y un mes después, cuando IgG se hizo la más prevalente. No se observaron diferencias significativas entre hombres y mujeres, pero sí se observó una mayor producción de anticuerpos al inicio de la enfermedad en pacientes menores de 75 años, aunque en las muestras siguientes, los resultados se igualaron en todos los grupos de edad. En el segundo capítulo se evaluó la capacidad in vitro de los anticuerpos generados contra la cepa salvaje del SARS-CoV-2 y las variantes B.1, B.1.1.7 y B.1.351 después de la vacunación de personal sanitario del Hospital Universitario Clínico San Cecilio de Granada (España) con BNT162b2 utilizando un ensayo de neutralización de virus completo. Para ello, se recogieron muestras de suero de 99 trabajadores de la salud (76 mujeres, 23 hombres, con una media de edad de 44 años) que recibieron dos dosis de la vacuna BNT162b2 entre enero y febrero de 2021 (tercera ola en España), de los cuales, solo 11 habían estado previamente expuestos al SARS-CoV-2. Se recogieron muestras de suero coincidentes con el día de la administración de cada dosis y 14 días después. Se utilizaron virus vivos completos de la cepa salvaje y las variantes B.1, B.1.1.7 y B.1.351 y células Vero E6. Los resultados se obtuvieron tras la observación al microscopio del efecto citopático (CPE). Tras el análisis de las muestras, se observó que el grupo de los preexpuestos demostró altos títulos de neutralización tras la primera dosis y un aumento menor tras la segunda, siendo al revés en el grupo de los no preexpuestos. En ambos grupos, la neutralización contra la variante B.1.1.7 alcanzó valores similares a los de la cepa salvaje, pero en el caso de la variante B.1.351, los títulos de neutralización fueron menores.

Since December 2019, the world has experienced an unprecedented situation in recent history. From China, a hitherto unknown virus was spread. Sequencing its genome, it was soon related to the coronavirus family and received the name of SARS-CoV-2, and the disease it produced, COVID-19. It caused a pandemic with serious consequences for the economy and health around the world. During this time, considerable resources have been devoted, not only to diagnosing the population and treating the sick, but also to gathering as much information as possible about the virus in order to combat it. At this point, the production of anti-disease drugs, qualified health personnel and the development in record time of effective vaccines with technologies approved for the first time in history, such as messenger RNA vaccines, have been strengthened to stop the expansion of the virus. The aim of this thesis is to collect the most relevant information about SARS-CoV-2 and COVID-19 and to present the results obtained in the studies carried out at the San Cecilio Clinical University Hospital in Granada (Spain) on humoral immunity induced by the virus. In the first chapter, the production of anti-SARS-CoV-2 antibodies was characterised using serum samples from 1,236 patients admitted for COVID-19 and with SARS-CoV-2 infection confirmed by RT-PCR between April and July 2020 (first wave in Spain) in 18 healthcare centres in Spain and their production was determined based on age and sex. The determination of IgM + IgA and IgG antibodies was performed by ELISA techniques and showed that IgM + IgA had higher reactivity than IgG at the onset of the disease and up to 16 days later, being statistically significant one day after admission. The appearance of IgG was present from the seventh day after the positive PCR result and continued to increase three weeks later, when IgM + IgA and IgG reached similar values, and one month later, when IgG became the most prevalent. No significant differences were observed between men and women, but higher antibody production was observed at the beginning of the disease in patients under 75 years, although in subsequent samples, the results were equal in all age groups. In the second chapter, the in vitro capacity of antibodies generated against the SARSCoV- 2 wild-type strain and B.1, B.1.1.7 and B.1.351 variants after vaccination of healthcare workers at the San Cecilio Clinical University Hospital in Granada (Spain) with BNT162b2 was evaluated using a whole virus neutralisation assay. For this purpose, serum samples were collected from 99 healthcare workers (76 women, 23 men, with a mean age of 44 years) who received two doses of BNT162b2 vaccine between January and February 2021 (third wave in Spain), of whom only 11 had been previously exposed to SARS-CoV-2. Serum samples were collected coincident with the day of administration of each dose and 14 days later. Live whole virus of the wild-type strain and of B.1, B.1.1.7 and B.1.351 variants and Vero E6 cells were used. Results were obtained after microscopic observation of the cytopathic effect (CPE). After analysing the samples, it was observed that the pre-exposed group showed higher neutralisation titers after the first dose and a lower increase after the second dose, while the opposite was true for the non-pre-exposed group. In both groups, neutralisation against the B.1.1.7 variant reached values similar to those of the wild-type strain, but in the case of the B.1.351 variant, the neutralisation titers were lower.