El microbioma de olivo en condiciones de estrés a-biótico: posibilidades biotecnológicas para incrementar la resiliencia del olivar

Abstract

El olivo es un cultivo de enorme relevancia para la sociedad, la cultura y economía de la Cuenca Mediterránea. La producción de su aceite supone una importante fuente económica para numerosos países, siendo España el primer productor y exportador del mundo. Sin embargo, este cultivo se está viendo cada vez más amenazado por diversos estreses, tanto bióticos como abióticos, que se relacionan y agravan con los fenómenos asociados al cambio climático. Dentro de estos estreses, cabe destacar el manejo agrícola aplicado, cuya tendencia en las últimas décadas se acerca a modelos intensivos o súper intensivos (con densidades de 200 a 2.500 árboles/ha), con un alto uso de productos fitosanitarios y una mayor mecanización de la recolección. Esto acarrea diversos impactos medioambientales que afectan tanto a la biodiversidad de flora, fauna y microorganismos, así como a la salud del suelo. Como resultado, se generan ecosistemas menos resilientes frente a estreses abióticos, como los debidos al cambio climático, algo especialmente relevante en la Cuenca Mediterránea, o a factores bióticos como el ataque de patógenos. Además, el manejo agrícola tiene un impacto en las comunidades microbianas del suelo y asociadas a la planta, las cuales se encuentran en estrecha relación con la salud vegetal. Así, existe un creciente interés por implementar prácticas agrícolas más sostenibles, donde destacan técnicas como la inoculación de microorganismos beneficiosos para la planta o el uso de prácticas agrícolas más respetuosas con las comunidades microbianas del suelo y de la planta. Para el desarrollo de esta Tesis Doctoral se abordó el objetivo de estudiar el microbioma de la raíz y del suelo rizosférico del olivo en respuesta a diversos tipos de estrés, como el manejo agrícola aplicado y la verticilosis del olivo. Asimismo, se planteó el estudio de reservorios de microorganismos menos explorados, tales como la endosfera radicular y la semilla del olivo. En este sentido, se realizaron aislamientos de bacterias a partir de raíces de olivo y se describió, por primera vez, la microbiota de la semilla. En primer lugar, esta Tesis Doctoral se basa en el uso de la secuenciación masiva para la caracterización de las comunidades microbianas asociadas al sistema radicular del olivo, generando grandes cantidades de datos que requieren herramientas bioinformáticas especializadas para su análisis. La diversidad y complejidad de estas herramientas, junto con la necesidad de formación específica por parte del usuario/investigador, afectan en gran medida a la reproducibilidad de los análisis. Para abordar este aspecto, se desarrolló un flujo de trabajo con una librería de funciones en R, que combina la facilidad de uso e implementación con la capacidad de personalización del análisis (https://nuriamw.github.io/micro4all/tutorial/package_workflow.html). Esta herramienta ha sido fundamental tanto para el análisis de datos de la Tesis Doctoral como para investigaciones de varios grupos de investigación, demostrando su utilidad en distintos contextos científicos. Por otro lado, para investigar el impacto del manejo agrícola en las comunidades microbianas de la raíz del olivo, se llevaron a cabo dos estudios independientes. El primero se centró en el estudio de la comunidad rizosférica de un olivar convencional y de un bosque de encinas adyacente al mismo. El segundo consistió en el estudio de las comunidades rizosféricas y endófitas de olivos en fincas cercanas con dos manejos agrícolas diferentes: uno convencional y otro orgánico con estiércol de oveja. Los resultados de ambos estudios demostraron la influencia del manejo agrícola en las comunidades microbianas a diversos niveles. En primer lugar, se encontró un mayor contenido de nutrientes en el suelo, tanto en el bosque de encinas como en el olivar bajo manejo orgánico, lo que sugiere que prácticas agrícolas convencionales tales como el arado y retirada de material vegetal afectan negativamente a las propiedades nutricionales del suelo. Por otro lado, tanto la diversidad α como la β fueron diferentes entre los manejos agrícolas estudiados, tanto en las comunidades de la rizosfera como de la endosfera. Además, la biomasa fúngica de la rizosfera fue significativamente mayor en los olivos crecidos bajo un manejo orgánico, lo que podría aumentar la presencia de hongos con funciones beneficiosas para la planta. A nivel de composición taxonómica, tanto la comunidad bacteriana como la fúngica se vieron afectadas de manera acorde al manejo aplicado. Los suelos de olivares más pobres en nutrientes se vieron enriquecidos en taxones oligotróficos y asociados a menor contenido de agua en el suelo, como Acidobacteria y Gemmatimonadetes. En estas fincas, se encontró una mayor abundancia relativa de géneros relacionados con la degradación de herbicidas y pesticidas, tales como Rubrobacter y Sphingomonas. Por su parte, en la finca con manejo orgánico, se observó un enriquecimiento en géneros fúngicos relacionados con producción de compuestos antimicrobianos y promoción del crecimiento vegetal (Preussia y Cladophialophora). Además, el manejo orgánico se asoció con un aumento en funciones metabólicas bacterianas relevantes para la planta, como el ciclo del nitrógeno (Nitrospira), degradación de compuestos aromáticos y defensa frente a patógenos (quitinolisis). Por último, las redes de coocurrencia microbiana mostraron una mayor complejidad de la red y una menor distancia geodésica media (GD) en la finca con manejo orgánico, lo que se relaciona con comunidades más resilientes a perturbaciones. Los resultados aquí descritos sientan un precedente en cuanto al microbioma del olivo, ya que no se encuentran hasta la fecha estudios en este respecto que incluyesen comunidad bacteriana, fúngica, endosfera y rizosfera, así como determinación de parámetros fisicoquímicos del suelo, biomasa microbiana y análisis de redes de coocurrencia en condiciones de campo. Si bien el manejo agrícola constituye un estrés abiótico para el olivar, la verticilosis del olivo podría considerarse como uno de los estreses bióticos más devastadores de este cultivo. En esta Tesis Doctoral, se abordó por primera vez el estudio de la microbiota de la rizosfera de olivos crecidos en condiciones de campo con tolerancias diferenciales a la verticilosis, esto es, usando los genotipos modelo de tolerancia y susceptibilidad, Frantoio y Picual, respectivamente. Según nuestros resultados, no se encontró una diferencia clara entre las comunidades bacterianas y fúngicas de la rizosfera de ambos genotipos, lo que podría relacionarse con el manejo agrícola aplicado. Futuros estudios serán necesarios para elucidar si las diferencias podrían observarse en la endosfera de la raíz. En cuanto al estudio de reservorios poco explorados de microorganismos potencialmente beneficiosos para el olivar, se abordó el aislamiento de microorganismos de la endosfera radicular. Debido a resultados anteriores que apuntan a la importancia del género Actinophytocola en la comunidad bacteriana de la endosfera radicular del olivo, se llevaron a cabo diversos métodos de aislamiento para obtener aislados de este género. Ninguno de ellos resultó exitoso, si bien se obtuvieron aislados de otros géneros de interés biotecnológico, tales como Streptomyces, Nocardia, Kocuria, Paenibacillus y Rhizobium. Estos resultados constituyen el primer aislamiento publicado de bacterias de estos géneros a partir de la endosfera de olivo, sentando las bases para futuros estudios centrados en su caracterización taxonómica y funcional, y su posible utilización como inoculantes beneficiosos para el cultivo del olivo. Otro reservorio de microorganismos completamente desconocido en el caso del olivar es la semilla del olivo. En esta Tesis Doctoral, se describe por primera vez un procedimiento para la obtención de semillas de olivo en condiciones de esterilidad, así como la composición de las comunidades bacterianas y fúngicas que las colonizan. Según nuestros resultados, la microbiota de la semilla de olivo presentó características únicas respecto al de otras especies vegetales. Destaca la presencia de Actinobacteria como el phylum bacteriano más abundante, con Streptomyces como el género más abundante. Basidiomycota y Ascomycota fueron los phyla fúngicos predominantes, representados por los géneros Malassezia, Cladosporium y Mycosphaerella. Además, se identificó una microbiota compartida entre las semillas de los distintos genotipos analizados, compuesto por cuatro géneros bacterianos (Stenotrophomonas, Streptomyces, Promicromonospora y Acidipropionibacterium) y tres fúngicos (Malassezia, Cladosporium y Mycosphaerella). La comparación con resultados anteriores de la endosfera de raíces de los mismos árboles, demuestra la presencia de géneros como Streptomyces y Malassezia en ambas partes de la planta, apuntando a posibles mecanismos de transmisión vertical de microorganismos. Además, se identificó el genotipo del olivo como un factor determinante de la estructura de la comunidad microbiana de la semilla. En general, se encontraron géneros con potenciales funciones beneficiosas para la planta, tales como Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, Sphingomonas y Cladosporium. Como conclusión, los resultados de esta Tesis Doctoral muestran la influencia del manejo agrícola en el microbioma del suelo y de la raíz del olivo, con potenciales implicaciones para la salud de la planta. Los manejos agrícolas menos invasivos, con mayores aportes de materia orgánica, modifican la diversidad y biomasa microbianas y enriquecen la comunidad en géneros potencialmente beneficiosos para la nutrición y crecimiento del olivo, además de mejorar la composición nutricional del suelo y sus redes de coocurrencia. Por otro lado, los resultados aquí descritos no apoyan la presencia de una microbiota rizosférica diferencial entre genotipos de olivo tolerantes y susceptibles a la verticilosis en condiciones de campo. Por último, destacamos el olivo como una fuente de microorganismos potencialmente beneficiosos para la planta, tanto por los aislados obtenidos de la endosfera radicular, como por la composición bacteriana y fúngica de la microbiota de la semilla. Esta es la primera descripción de la microbiota asociada a semillas de olivo, lo que sienta un precedente para futuros estudios centrados en aislamiento y caracterización de los miembros de su microbioma, así como para programas de mejora genética de la planta.

The cultivation of the olive tree (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea) has for millennia been a key element in the nutrition, society, economy and culture of countries located in the Mediterranean Basin. Hence, olive oil production constitutes a very important economic source for many countries, with Spain being the world's largest producer and exporter. However, this crop faces growing threats from a range of biotic and abiotic stresses, interconnected and exacerbated by climate change. Among these stresses, it is worth highlighting the agricultural management of the field. In recent decades, the trend has shifted towards intensive or super-intensive models, characterized by high tree densities ranging from 200 to 2,500 trees/ha, extensive use of phytosanitary products, and increased mechanization of harvesting. This leads to various environmental impacts that affect the flora, fauna and microbial biodiversity, as well as soil health. As a result, ecosystems become less resilient to adverse climatic events (especially relevant in the Mediterranean Basin) and plant pathogens. Moreover, agricultural management has an impact on soil and plant-associated microbial communities, which are closely related to plant health. Hence, there is a rising interest in adopting more sustainable agricultural practices, with a focus on techniques such as the inoculation of plant-beneficial microorganisms and applying farming methods that are less disruptive of the soil and plant microbial communities. With all the above said, the aim of this PhD was to study the root and rhizosphere soil microbiome of olive trees in relation to different stresses, such as agricultural management and verticilosis wilt of olive. Moreover, we also delved into less explored sources of microorganisms, including the root endosphere and the olive seed. To achieve this, bacterial isolation was conducted from olive roots and the olive seed microbiome was described for the first time. First of all, this PhD is based on the use of next-generation sequencing for the characterisation of microbial communities associated with olive tree root system. These sequencing platforms generate large amounts of data that require specialised bioinformatics tools for their analyses. The variety and complexity of these tools, together with the need of specific training, greatly affect the reproducibility of the analyses. To address this, a workflow was developed along with a library of functions in R, combining ease of use and customizable analysis options (https://nuriamw.github.io/micro4all/tutorial/package_workflow.html). This workflow has proven valuable not only for data analysis in this PhD, but also for several research articles from international research groups. In order to investigate the impact of agricultural management on olive root microbial communities, two independent studies were carried out. The first focused on the study of the rhizosphere community of a conventional olive field and an adjacent holm oak forest. The second study evaluated the rhizospheric and endophytic communities of olive trees in nearby orchards with two different agricultural management systems: conventional and organic with sheep manure amendment applied to the soil. The results of both studies demonstrated the influence of agricultural management on microbial communities at different levels. First, a higher soil nutrient content was found in both the holm oak forest and the olive grove under organic management, suggesting that conventional agricultural practices such as ploughing and removal of plant material negatively affect soil nutritional properties. On the other hand, both α-diversity and β-diversity were different between the agricultural managements studied, both in the rhizosphere and endosphere communities. In addition, the fungal biomass of the rhizosphere was significantly higher in olive trees grown under organic management, which could increase the presence of fungi with beneficial functions for the plant. At the level of taxonomic composition, both the bacterial and fungal community were affected by agricultural management. The olive orchard soils with the lowest nutrient content exhibited an enrichment of oligotrophic taxa linked to lower soil water content, including Acidobacteria and Gemmatimonadetes. On these orchards, a higher relative abundance of genera related to herbicide and pesticide degradation was found, such as Rubrobacter and Sphingomonas. On the other hand, a higher relative abundance of fungal genera related to antimicrobial compound production and plant growth promotion (Preussia and Cladophialophora) was observed in the organic orchard. Furthermore, organic management was associated with an increase in plant-relevant bacterial metabolic functions, such as nitrogen cycling (Nitrospira), degradation of aromatic compounds and defence against pathogens (chitinolysis). Finally, microbial co-occurrence networks showed higher network complexity and lower mean geodesic distance (GD) in the orchard under organic management, which is related to more resilient communities. Our results set a precedent in terms of the olive microbiome, as there are no studies to date in this regard that include bacterial, fungal, endosphere and rhizosphere communities, as well as determination of soil physico-chemical parameters, microbial biomass and co-occurrence network analysis under field conditions. While agricultural management constitutes an abiotic stress for olive orchards, verticillium wilt of olive (VWO) may be considered as one of the most devastating biotic stresses for this crop. In this PhD, for the first time, we investigated the root microbiota (rhizosphere) of olive trees cultivated under field conditions with differential tolerance to VWO (Frantoio and Picual). According to our results, no clear difference was found between the bacterial and fungal communities in the rhizosphere of both genotypes, which could be related to the agricultural management applied. Future studies will be necessary to elucidate whether differences could be observed in the root endosphere. One of the objectives of this PhD was to obtain bacterial isolated from less explored microbial sources of olive trees. In this regard, the isolation of microorganisms from the root endosphere was addressed. Due to prior results highlighting the importance of Actinophytocola genus in the bacterial community of the olive root endosphere, various methods were used to isolate members of this genus. Although none of these methods were successful for Actinophytocola, isolates of other genera with biotechnological interest was achieved, such as Streptomyces, Nocardia, Kocuria, Paenibacillus and Rhizobium. These results constitute the first published isolation of bacteria of these genera from olive endosphere, laying the groundwork for future studies focused on their taxonomic and functional characterisation, along with their potential application as beneficial inoculants for olive cultivation. Apart from the olive root endosphere, olive seeds constitute a completely unknown source of microorganisms. In this sense, we describe for the first time a procedure for obtaining olive seeds under sterile conditions, as well as the composition of their bacterial and fungal communities. According to our results, the microbiota of olive seed showed unique characteristics compared to other plant species. Actinobacteria was the most abundant bacterial phylum, with Streptomyces standing out at genus level. Basidiomycota and Ascomycota were the predominant fungal phyla, represented by genera Malassezia, Cladosporium and Mycosphaerella. In addition, a shared microbiota was identified among the genotypes analysed, consisting of four bacterial genera (Stenotrophomonas, Streptomyces, Promicromonospora and Acidipropionibacterium) and three fungal genera (Malassezia, Cladosporium and Mycosphaerella). When compared to previous findings from the root endosphere of the same trees, the identification of genera Streptomyces and Malassezia in both plant compartments suggests potential mechanisms of vertical transmission of microorganisms. In addition, the genotype was identified as a key factor determining the structure of the seed microbial community. Overall, olive tree seeds harboured genera with potential beneficial functions for the plant, such as Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, Sphingomonas and Cladosporium. In conclusion, our results show the influence of agricultural management on the soil and root microbiome of olive trees, with potential implications for plant health. Adopting less invasive agricultural practices with increased organic matter inputs alters microbial diversity and biomass, enhancing the community with genera that could be beneficial for olive nutrition and growth. This also improves the nutritional composition of the soil and its co-occurrence networks. However, our results do not support the presence of a differential rhizosphere microbiota between olive genotypes with different tolerance levels to VWO under field conditions. Lastly, we highlight the olive tree as a source of potentially beneficial microorganisms for the plant, including those isolated from the root endosphere and the bacterial and fungal components of the seed microbiota. This is the first description of the microbiota associated with olive seeds, which sets a precedent for future studies focused on isolation and characterisation of the members of its microbiome, as well as for plant breeding programmes.