Comunidades bacterianas asociadas al ciclo de hg en ecosistemas amazónicos intervenidos por minería

Abstract

En Colombia en las dos últimas décadas la minería se ha convertido en un motor de desarrollo económico. La explotación minera en la Amazonia Colombiana ha aumentado considerablemente, debido a la riqueza en minerales como oro, cadmio, cobalto, cobre, estaño, hierro, molibdeno, petróleo, carbón, asfaltita, arcilla, mármol, entre otros. Uno de los procesos de perturbación que más afecta a la región es el uso de mercurio (Hg) en la minería de oro artesanal a pequeña y mediana escala. El mercurio es uno de los metales con mayor impacto en los ecosistemas acuáticos y terrestres debido a la exposición biótica a metilmercurio (MeHg), un compuesto iónico altamente tóxico derivado de la biometilación de Hg, que se bioacumula y biomagnifica por su paso entre cada eslabón de la cadena trófica, llegando a afectar no solamente a la salud de los pobladores de la región, sino también a la de los ecosistemas acuáticos. La contaminación por Hg en los cuerpos de agua afectan la calidad de los recursos pesqueros, los cuales en la Amazonia colombiana no sólo son la base de la seguridad alimentaria de los pobladores de la región (indígenas y colonos campesinos), sino que también afectan la actividad económica que la pesca representa, al ser fuente importante de ingresos monetarios locales. Ante el incremento de las descargas de Hg a los ecosistemas acuáticos, producto de su uso en la amalgamación del oro y a las emisiones atmosféricas provocadas por el calentamiento de la amalgama oro-Hg, es necesario cuantificar las cantidades de este elemento en las matrices abióticas (agua, sedimento y suelo) y evaluar las comunidades microbianas relacionadas con las transformaciones del Hg (reducción y metilación) en ecosistemas amazónicos expuestos a minería, para generar la línea base que permita entender la problemática del Hg en la región, crear herramientas de monitoreo, así como diseñar estrategias de biorremediación a medio y largo plazo que contribuyan a la restauración de los ecosistemas contaminados. Esta tesis se centró en el estudio de la diversidad de comunidades microbianas en aguas, sedimentos y suelos en dos localidades de la Amazonía colombiana (Tarapacá y Taraira) donde durante más de 20 años se ha realizado la extracción de oro con Hg de forma artesanal y a pequeña y mediana escala. Para ello se tomaron muestras de las matrices agua, sedimento y suelo de bosque en distintos puntos seleccionados de ambas localidades, que se analizaron para determinar: i) las concentraciones de mercurio total (THg) y metilmercurio (MeHg) en las tres matrices, así como su biodisponibilidad en suelos y sedimentos; ii) la diversidad de las comunidades microbianas presentes, utilizando secuenciación de alto rendimiento (illumina); iii) la abundancia de los genes merA (reducción de mercurio) y hgcA (metilación de mercurio) utilizando PCR en tiempo real. Paralelamente se trabajó en el aislamiento de microorganismos resistentes a mercurio, su identificación taxonómica, la determinación de sus niveles de resistencia, la identificación y expresión del merA, la susceptibilidad a antibióticos, para generar una colección de bacterias nativas resistentes a Hg, valiosas para el desarrollo de estrategias de biorremediación para la región. Finalmente se secuenció el genoma completo de las dos cepas más resistentes a mercurio utilizando dos tecnologías complementarias (Illumina y Nanopore). Los resultados mostraron que las concentraciones de THg y MeHg variaron entre las dos localidades (Tarapacá y Taraira) y según el tipo de matriz evaluada (agua, sedimentos y suelos aluviales), siendo los sedimentos y los suelos aluviales de la localidad de Taraira los que contenían las concentraciones más altas de este metal, alcanzando valores más de sesenta veces superiores a los límites internacionales para sedimentos (0,094 mg Hg Kg-1) según la legislación canadiense. Los 26 años de actividad minera en Taraira han ocasionado graves impactos en los ecosistemas de la región, ocasionando no sólo deforestación por la minería de socavón (tierra adentro), sino también la contaminación de los cuerpos de agua por Hg. El análisis de la diversidad de comunidades bacterianas basada en el gen 16S secuenciado por Illumina evidenció poco efecto del Hg sobre la estructura de las comunidades microbianas en los sedimentos y suelos con los niveles más altos de mercurio total, mientras que variables como la textura (% de arcillas y arenas), la presencia de nutrientes (contenidos de aniones y cationes) y de carbono orgánico, fueron los factores que modularon la composición microbiana; estos parámetros fisicoquímicos presentaron valores más altos en las matrices muestreadas en Tarapacá, lo que se asocia con una mayor disponibilidad de nutrientes en los sedimentos y suelos de esta localidad, que al provenir de ríos con aguas blancas, arrastran mayor contenido de nutrientes indispensables para el crecimiento y actividad microbiana. Los análisis de diversidad de la comunidad total por Illumina mostraron que la composición microbiana en las aguas, sedimentos y suelos de las dos localidades estaba dominada por los Phylum Proteobacteria, Acidobacteria, Plantomycetes, Actinobacteria y Bacteriodetes. La evaluación de biodisponibilidad de Hg en los suelos y sedimentos con los valores más altos de Hg, mostró que en siete de las ocho muestras evaluadas, el Hg se encontró en la fracción inmóvil (Hg-s y Hg-e), y por lo tanto no estaba biodisponible para las transformaciones microbianas, lo que podría también explicar el poco efecto observado de este metal sobre las comunidades. Los resultados de la cuantificación por PCR en tiempo real de los genes merA y hgcA evidenciaron una mayor abundancia en cuanto al número de copias de estos genes en las muestras de la localidad de Taraira que en las de Tarapacá, sugiriendo una actividad de las comunidades reductoras y metiladoras de Hg, asociado posiblemente a una mayor contaminación por Hg en esta localidad. El aislamiento de bacterias resistentes a Hg permitió la recuperación e identificación de 72 cepas bacterianas y 10 cepas de levaduras. Las pruebas de resistencia a HgCl2 (0-120 mg L-1) permitieron determinar las concentraciones mínimas inhibitorias para cada aislamiento y seleccionar dos cepas (TP30 y TR100) que mostraron un crecimiento excepcional, incluso a una concentración de HgCl2 de 100 mg L-1. Estas cepas pertenecen a los géneros Pseudomonas y Burkholderia, respectivamente y mostraron actividad reductora de mercurio en ensayos in vitro con una reducción del 50% del Hg añadido al medio de cultivo, atribuida a la actividad de la enzima reductasa mercúrica, cuya expresión se inducía fuertemente en presencia de 10 mg L-1 de HgCl2, como se determinó en los ensayos de RT-qPCR. La secuenciación del genoma completo de estas cepas permitió, además de la asignación taxonómica precisa como Pseudomonas paracarnis (TP30) y Burkholderia contaminans (TR100), determinar la presencia de una única copia del operón mer en ambos genomas, así como de genes de resistencia a otros metales. La presencia de los genes merA y merB les confiere una resistencia de amplio espectro, tanto a Hg como a MeHg, lo que las convierte en excelentes candidatas para su incorporación en consorcios microbianos para la remediación de Hg en ecosistemas contaminados en la Amazonia Colombiana.

In Colombia, mining has become an engine of economic development in the last two decades. Mining in the Colombian Amazon has increased considerably due to the wealth of minerals such as gold, cadmium, cobalt, copper, tin, iron, molybdenum, petroleum, coal, asphaltite, and clay. One of the most disturbing processes affecting the region is the use of mercury (Hg) in small and medium-scale artisanal gold mining. Mercury (Hg) is one of the metals with the most significant impact on aquatic and terrestrial ecosystems due to biotic exposure to methylmercury (MeHg), a highly toxic ionic compound derived from Hg biomethylation, which bioaccumulates and biomagnifies as it passes through each link in the trophic chain, affecting not only the health of the region's inhabitants but also that of aquatic ecosystems. Hg contamination in water bodies affects the quality of fishery resources, which in the Colombian Amazon are not only the basis of food security for the region's inhabitants (indigenous peoples and peasant settlers) but also affect the economic activity that fishing represents as an essential source of local monetary income. Given the increase in Hg discharges to aquatic ecosystems as a result of its use in gold amalgamation and atmospheric emissions caused by the heating of gold-Hg amalgam, it is necessary to quantify the amounts of this element in abiotic matrices (water, sediment, and soil) and evaluate the microbial communities related to Hg transformations (reduction and methylation) in Amazonian ecosystems exposed to mining, to generate a baseline that will allow understanding the Hg problem in the region, create monitoring tools, and design medium and long-term bioremediation strategies that will contribute to the restoration of contaminated ecosystems. This thesis focused on the study of the diversity of microbial communities in water, sediments, and soils in two localities of the Colombian Amazon (Tarapacá and Taraira), where artisanal, small, and medium-scale gold mining with Hg has been carried out for more than 20 years. To this end, samples were taken from the water, sediment and forest floor matrices at different selected points in both locations, which were analyzed to determine: i) the concentrations of total mercury (THg) and methylmercury (MeHg) in the three matrices, as well as their bioavailability in soils and sediments; ii) the diversity of microbial communities present, using high-throughput sequencing (ILLUMINA); iii) the abundance of the merA (mercury reduction) and hgcA (mercury methylation) genes using real-time PCR. At the same time, work was carried out on the isolation of mercury-resistant microorganisms, their taxonomic identification, the determination of their resistance levels, the identification and expression of merA, the susceptibility to antibiotics, to generate a collection of native Hgresistant bacteria, valuable for the development of bioremediation strategies for the region. Finally, the entire genome of the two most mercury-resistant strains was sequenced using two complementary technologies (Illumina and Nanopore). The results showed that mercury concentrations (THg and MeHg) varied between the two localities (Tarapacá and Taraira) and according to the type of matrix evaluated (water, sediments and alluvial soils), with the sediments and alluvial soils of the Taraira locality containing the highest concentrations of this metal, reaching values more than sixty times higher than the international limits for sediments (0.094 mg Hg Kg-1) according to Canadian legislation. The 26 years of mining activity in Taraira have severely impacted the region's ecosystems, causing deforestation from underground mining (inland) and contamination of water bodies by Hg. 16S rRNA gene-based Illumina's analysis of bacterial community diversity showed little effect of Hg on the structure of microbial communities in sediments and soils with the highest levels of total mercury. At the same time, variables such as texture (% of clays and sands), the presence of nutrients (anion and cation content), and organic carbon modulated the microbial composition. These physicochemical parameters presented higher values in the matrices sampled in Tarapacá, which is associated with greater availability of nutrients in the sediments and soils of this locality, which, coming from rivers with “white water”, carry a higher content of nutrients essential for microbial growth and activity. The diversity analysis of the total community by Illumina showed that the microbial composition in the waters, sediments, and soils of the two localities was dominated by the Phylum Proteobacteria, Acidobacteria, Plantomycetes, Actinobacteria, and Bacteriodetes. The evaluation of Hg bioavailability in soils and sediments with the highest Hg values showed that in seven of the eight samples evaluated, Hg was found in the immobile fraction (Hg-s and Hg-e), and, therefore, was not bioavailable for microbial transformations, which could also explain the little effect observed on the communities. The results of real-time PCR quantification of the merA and hgcA genes showed a higher abundance in terms of the number of copies of these genes in the samples from the Taraira locality than in those from Tarapacá, suggesting the activity of Hg-reducing and methylating communities, possibly associated with more significant Hg contamination in this locality. The isolation of Hg-resistant bacteria allowed the recovery and identification of 72 bacterial strains and ten yeast strains. HgCl2 resistance tests (0-120 mg L-1) allowed determining the minimum inhibitory concentrations (MIC) for each isolate and the selection two strains (TP30 and TR100) that showed exceptional growth, even at a HgCl2 concentration of 100 mg L-1. These strains belong to the genera Pseudomonas and Burkholderia, respectively, and showed mercury-reducing activity in in vitro assays with a 50% reduction of Hg added to the culture medium, attributed to mercuric reductase enzyme activity, whose expression was strongly induced in the presence of 10 mg L-1, as determined by RT-qPCR assays. Whole genome sequencing of these strains allowed, in addition to precise taxonomic assignment as Pseudomonas paracarnis (TP30) and Burkholderia contaminans (TR100), to determine the presence of a single copy of the mer operon in both genomes, as well as genes for resistance to other metals. The merA and merB genes confer broad-spectrum resistance to both Hg and MeHg, making them excellent candidates for their incorporation into microbial consortia for Hg remediation in contaminated ecosystems in the Colombian Amazon.