Interactoma de las exovesículas de Trypanosoma cruzi con las células del hospedador; Implicaciones en la patología de la Enfermedad de Chagas

Abstract

Trypanosoma cruzi, es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, un protozoo flagelado de multiplicación intracelular obligada en el hospedador mamífero. En su ciclo biológico intervienen insectos triatominos hematófagos y hospedadores mamíferos. La enfermedad cursa con una fase aguda, seguida de una fase crónica en la que alrededor del 30-40% de los pacientes desarrollan sintomatología cardiaca o digestiva severa. La obtención y separación de las vesículas extracelulares (EVs) utilizadas en esta tesis doctoral, se realizó mediante una metodología puesta a punto por nuestro grupo de investigación, la cual contiene procedimientos combinados de centrifugación, filtración y ultracentrifugación diferencial a partir de cultivos de tripomastigotes de T. cruzi de la cepa Pan4, perteneciente al UDT I. El tamaño de las EVs obtenidas ha sido estudiado mediante nanoparticle tracking analysis, microscopía electrónica de transmisión y microscopía de fuerza atómica. El trabajo llevado a cabo en el capítulo 1 de esta tesis doctoral se centra en el análisis comparativo de la carga de proteínas de las EVs, con un tamaño correspondiente a los exosomas, liberadas por las formas infectantes y no infectantes de T. cruzi. De igual manera, se estudiaron las diferencias en algunas de sus propiedades nanomecánicas (adhesión, elasticidad y potencial Z), mostrando las EVs liberadas por tripomastigotes un mayor número de proteínas que las formas epimastigotes, especialmente de transialidasas. Además, las EVs liberadas por tripomastigotes mostraron una capacidad de adhesión mayor, así como una elasticidad y rigidez menor, lo que explicaría, la capacidad de las EVs provenientes de las formas infectantes de interaccionar con las células del mamífero. Los estudios de las modificaciones que estas últimas EVs inducen en la transcriptómica de las células con las que interaccionan han sido estudiados en el capítulo 2. En dicho capítulo estudiamos el efecto en la transcripción génica de las células no infectadas tras la interacción con las EVs liberadas por los tripomastigotes. Se comprobó como existe una regulación diferencial de 322 genes celulares (168 genes sobreexpresados y 154 mostraron una reducción de la expresión génica). Entre los genes que se modifican al alza la expresión, destacan los genes relacionados con procesos de ubiquitinación, concretamente con la SUMOilación y una regulación a la baja de los genes implicados en la señalización celular, destacando aquellos que participan en la funcionalidad del citoesqueleto y en el ciclo celular (RhoA, Rac1 y CDC42). Estos resultados explicarían trabajos previos de nuestro grupo, donde la interacción con las EVs provenientes de las formas infectantes del parásito interrumpen el ciclo celular en la fase G0/G1 de la célula. Por otra parte, se observó una sobreexpresión de algunos genes implicados en la inhibición de la apoptosis, resultado que fue confirmado mediante citometría de flujo (anexina V-FITC), sugiriendo un efecto antiapoptótico de las EVs segregadas por formas infectivas en células no inmunitarias. En el capítulo 3 de esta tesis doctoral se estudió el potencial papel inmunomodulador que ejercen las EVs de los tripomastigotes de T. cruzi sobre los macrófagos peritoneales de ratón, bien como EVs libres o bien formando inmunocomplejos con IgGs específicas que reconocen a los antígenos de T. cruzi. Además, se evaluó la influencia de la sialización de las IgG que forman los inmunocomplejos, dada la importancia creciente del papel inmunomodulador ejercido por la presencia del ácido siálico en las IgGs, el cual está mediado por los receptores FcγRs que se encuentran en la membrana de diversas células inmunitarias, entre otras, en los macrófagos. Las células que contienen los citados receptores interaccionan con la fracción Fc de las IgG circulantes activando la respuesta inmunitaria; mientras que los receptores FcγRIIb, pertenecientes a este grupo de receptores, ligan las IgGs que poseen ácido siálico en su parte glicosilada, las cuales pueden interaccionar con las células inmunitarias también a través de la lectina siglec (Sia-binding Ig-like lectin), induciendo una respuesta reguladora. Para el estudio de la inmunomodulación se inocularon EVs, EVs formando inmunocomplejos tanto con IgG sializadas como con IgG no sializadas, como control negativo se inoculó PBS y como control positivo se inocularon tripomastigotes de T. cruzi y LPS. Se analizaron las variaciones de las poblaciones de macrófagos peritoneales murinos que tienen lugar tras la inoculación, diferenciándose entre macrófagos peritoneales grandes (LPM), y macrófagos peritoneales pequeños (SPM); estas poblaciones se separaron por citometría de flujo y se analizó el perfil de citoquinas expresado por ambas poblaciones. Se demostró el aumento de la proporción de la población de SPM y consecuente la disminución de los LPM en la cavidad peritoneal tras la inoculación de EVs libres, así como un aumento aún más evidente tras la inoculación de los inmunocomplejos, tanto en aquellos formados con IgG sializadas como no sializadas. El estudio de la expresión de interleuquinas por parte de las dos poblaciones de macrófagos pone de manifiesto que las EVs libres tienen un efecto regulador de la activación de la respuesta inflamatoria, en cambio, los inmunocomplejos indujeron una respuesta más proinflamatoria, especialmente los inmunocomplejos formados con IgG no sializadas, demostrando de esta manera el papel antiinflamatorio asociado a la sialización de las IgG. Los resultados presentados en esta tesis doctoral demuestran la relevancia del papel protagonizado por las EVs liberadas por las formas tripomastigotes de T. cruzi en la supervivencia y mantenimiento del parásito en el hospedador mamífero.

Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan parasite which causes Chagas disease or American trypanosomiasis. In its life cycle it has haematophagous triatomine insects and mammalian hosts. The disease has an acute phase, followed by a chronic phase in which around 30-40% of patients develop severe cardiac or digestive symptoms. The obtention and separation of the extracellular vesicles (EVs) employed for this PhD was carried out performing a methodology developed by our research group, which contains procedures of centrifugation, filtration and differential ultracentrifugation from cultures of trypomastigotes of T. cruzi from the Pan4 strain, belonging to UDT I. The purity and size of the EVs obtained has been studied by nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy and atomic force microscopy. The research carried out in chapter 1 of this doctoral thesis focuses on the comparative analysis of the protein cargo of EVs released by infecting and non-infecting forms of T. cruzi. Likewise, the differences in some of their nanomechanical properties (adhesion, elasticity and Z potential) were analysed. The EVs released by trypomastigotes showed a greater number of proteins than the epimastigote forms, especially trans-sialidases. Moreover, EVs released by trypomastigotes showed a higher adhesion capacity, as well as lower elasticity and rigidity, which would explain the ability of EVs from the infecting forms to interact with mammalian cells. The modifications that these latter EVs induce in the transcriptomics of the cells with which they interact were studied in chapter 2. In this chapter we analysed the effect on gene transcription in uninfected cells after interaction with EVs released by trypomastigotes. The interaction promoted a differential regulation of 322 cellular genes, 168 genes were overexpressed while 154 genes were downregulated. Genes related to ubiquitination processes were overexpressed, specifically SUMOylation related genes, meanwhile genes involved in cell signalling were downregulated, highlighting those that participate in the functionality of the cytoskeleton and in the cell cycle (RhoA, Rac1 and CDC42). These results could explain previous work performed by our group, where the interaction with EVs shed by the infecting forms of the parasite interrupt the cell cycle in the G0/G1 phase of the cell. Moreover, an overexpression of some genes involved in the inhibition of apoptosis was observed, this result was confirmed by flow cytometry (annexin V-FITC), suggesting an antiapoptotic effect of EVs secreted by infective forms in non-immune cells. In chapter 3 of this doctoral thesis, the potential immunomodulatory role exerted by EVs released by T. cruzi trypomastigotes on mouse peritoneal macrophages was studied, either as free EVs or forming immune complexes with specific IgGs that recognize T. cruzi antigens. Furthermore, the influence of the sialylation of the IgGs that form the immune complexes was evaluated, given the growing importance of the exerted by the presence of sialic acid in the IgGs. This immunomodulatory role could be mediated by the FcγRs receptors found in the membrane of macrophages. Cells containing these receptors interact with the Fc fraction of circulating IgG, activating the immune response; while the FcγRIIb receptors, which belong to this group of receptors, bind sialyzed IgGs which can also interact with immune cells also through the lectin siglec (Sia-binding Ig-like lectin), both ways of interaction induce a regulatory response. To perform the immunomodulatory analysis, free EVs and EVs forming immune complexes with both sialylated IgG and nonsialylated IgG were inoculated. PBS was inoculated as a negative control and T. cruzi trypomastigotes and LPS were inoculated as positive controls. The modifications in the populations of murine peritoneal macrophages that occur after inoculation were analysed, differentiating between large peritoneal macrophages (LPM) and small peritoneal macrophages (SPM). These populations were sorted by flow cytometry and the cytokine profiles expressed by both populations were analysed. An increase in the proportion of the SPM population and a consequent decrease in LPM in the peritoneal cavity occurred after the inoculation of free EVs. An even more evident increase occurred after the inoculation of the immune complexes, both in those formed with IgG sialylated and non-sialylated. The analysis of the expression of interleukins by the two populations of macrophages showed that free EVs have a regulatory effect on the activation of the inflammatory response, whereas, the immune complexes induced a more proinflammatory response. Especially with immune complexes formed with non-sialylated IgG, thus demonstrating the anti-inflammatory role associated with the sialylation of IgG. The results presented in this doctoral thesis demonstrate the relevance of the role played by EVs released by the trypomastigote forms of T. cruzi in the survival and maintenance of the parasite in the mammalian host.