Estudio de la función de SLAMF8 en macrófagos

Abstract

Macrophages (Mϕ) are innate immune cells and main sentinels responsible for defense against microorganisms. In addition to being essential in the elimination of microorganisms through phagocytosis and their microbicidal mechanisms, they are powerful immunomodulatory cells capable of producing cytokines and presenting antigens, key processes in the immune response developed by this cell type. Phagocytosis is a process initiated by pattern recognition receptors (PRRs) located in these cells, which is followed by a series of cellular events involved in the elimination of the phagocyted microorganism. These events would be the microbicidal mechanisms, which in turn are highly regulated to avoid damage to the host cell. The regulation of these mechanisms occurs through different activation pathways, which may be initiated by signal transduction mediated by the participation of other receptor molecules. The SLAM family consists of 9 membrane receptors. Initially described as adhesion molecules responsible for the immunological synapse in T and NK cells, they act as immunomodulators of diverse functions at the innate and adaptive level, control the differentiation and lineage of hematopoietic cells, and also regulate microbicidal mechanisms in Mϕ, neutrophils and dendritic cells (DC). SLAMF8 is one of the last described members of this family, its expression is induced by stimulation with Gram-negative and Gram-positive bacteria, LPS and IFNγ in neutrophils, Mϕ and DC. In addition, its expression has been described in B cells and a low percentage of T cells, with no ascribed function. Previous studies to this doctoral thesis have shown that SLAMF8 acts as a negative regulator of NADPH oxidase (NOX2) activation through PKCδ and probably on the p38 MAPK pathway in mouse Mϕ, as well as having a possible involvement in the inflammatory response by negatively regulating the migration of Mϕ, among other cells, to the inflammatory focus. Given the described role of this SLAM family member on the negative regulation of NOX2 and its possible function on the inflammatory response, we decided to analyze in depth the effect of SLAMF8 on the regulation of these mechanisms in Mϕ. First, we performed a study of NOX2 activation through direct and indirect PKC pathways in SLAMF8 mouse deficient Mϕ (SLAMF8-/-) compared with Mϕ from the wild-type strain (WT or SLAMF8+/+). For this study cells were stimulated with PMA and pure LPS, and we employed specific inhibitors for PKC-, p38- MAPK and PI3K-mediated activation pathways. The results confirmed that, in the absence of SLAMF8, the activation of NOX2 through PCK was increased in the p47phox and p40phox subunits, detecting also an increased activation of p38 and ERK1/2 MAPK. The study with inhibitors confirmed these results, and furthermore not only showed negative modulation of NOX2 by SLAMF8 through these pathways, but also that specific inhibition of PI3K equalized the production of reactive oxygen species (ROS) between samples. Moreover, with PI3K inhibitor the observed differences in NOX2 activation pathways disappeared, equalizing the level of activation between Mϕ SLAMF8-/- and WT. Furthermore, analysis on the mobilization of NOX2 cytosolic subunits and the reorganization of the actin cytoskeleton showed that, SLAMF8 also negatively regulates these processes, probably through its action on PI3K. These results indicated that SLAMF8 effects negatively regulate processes involved in the elimination of microorganisms, therefore we analyzed the consequence that this receptor could have on the progression of severe infections. For this purpose, we used an in vitro Salmonella typhimurium infectious model. The results showed that SLAMF8 was able to negatively regulate the microbicidal mechanisms of NOX2 and iNOS, and their activation pathways in Mϕ, confirming again by the use of inhibitors that, the absence of SLAMF8 affects the activation pathway on these mechanisms by PI3K. In this study, we also observed that SLAMF8 affected the modulation process of S. typhimurium on NOX2 and iNOS activation on the SCV (Salmonella-containing vacuole), analyzing the activation of the enzymes at different SCV maturation times: early, intermediate and late. In order to confirm the modification in the composition of the SCV at different stages of maturation, we analyzed the recruitment of Rab5, Rab7 and p47phox to the SCV by laser confocal microscopy. According to the results obtained, it was concluded that the absence of SLAMF8 generated a greater fusion of phagosomes with lysosomes and an altered progression of the SCV, which probably generated an impairment in the capacity of S. typhimurium to control the progression of the SCV, essential for the maintenance and proliferation of the bacteria. All these lead us to conclude that SLAMF8 is able to negatively modulate the activation of microbicidal mechanisms through its action on PI3K. We believe that the intervention negatively modulates the PKC and PI3K feedback loop, since PI3K inhibition completely eliminates the observed differences between SLAMF8-/- and WT Mϕ stimulated with bacteria, PKC agonists or pure LPS. This is consistent with the fact that Mϕ SLAMF8-/- Mϕ exhibit increased polarization and migration, mechanism also controlled via the PKC-PI3K feedback loop. Considering that some of the SLAM family receptors can modulate Mϕ activation through their association with Toll-like receptors (TLRs), the expression of TLRs involved in Salmonella clearance was analyzed. The results showed a slight significantly higher increase in the expression of tlr2 and tlr4 in the absence of SLAMF8. Although, we do not believe that this small difference is the cause of the observed phenotype, it could also contribute to it. We also analyzed the expression of Slamf9, a member of the family implicated in the elimination of this microorganism, since has been described a combined action with SLAMF8 in a model of sepsis with LPS, through modulation of the expression of TLR4. We found no differences in the expression of Slamf9 in the model of infection with S. typhimurium in vitro. On the other hand, we did observe that, in the absence of SLAMF8, the expression of the cytokine il-6 was increased in this model of infection, which indicated that SLAMF8 effectively modulates the inflammatory response in Mϕ and therefore its action is effective during infectious processes. Next, the role of SLAMF8 on the Src kinase and SHP-1 phosphatase activation pathway was analyzed due to its involvement in NOX2 activation processes and intervention in the activation mechanisms for the elimination of microorganisms. The results showed a greater activation of Src kinases and a detriment in the activation of SHP-1 phosphatase in the absence of SLAMF8, under the model of infection with S. typhimurium in vitro. It was observed that IFNγ treatment in SLAMF8-/- Mϕ already increases Src activation, and furthermore, that under S. typhimurium stimulation further increased Src kinase activation accompanied by a detriment in SHP-1. This fact may be due to the increase in ROS production described as an activator of Src and inhibitor of SHP1. Hence, in conclusion, SLAMF8 also modulates the priming or initiation of Mϕ activation, since we observed that treatment with LPS or IFNγ already shows differences in their activation. The role of SLAMF8 on NOX2 and iNOS microbicidal mechanisms activation in mouse Mϕ was confirmed by murine SLAMF8 overexpression experiments in the RAW264.7 cell line, in which a phenotype opposite to that observed in SLAMF8 deficient Mϕ was obtained. Subsequently, confirmation that SLAMF8 acts as regulator of microbicidal mechanisms was obtained by studying SLAMF8 on the microbicidal capacity of S. typhimurium in vivo. The results indicated that SLAMF8-deficient mice had a higher microbicidal capacity than WT mice, and that in the absence of SLAMF8 there is a reduction in the proliferative capacity of S. typhimurium. These results are probably produced by the greater induction of iNOS and NOX2 detected in SLAMF8-/- mice, which consequently, would generate less phagosome acidification, as already observed in SLAMF8-/- Mϕ, which would prevent accelerated acidification of the SCV, an effect used by the bacterium for its replication. Finally, given its function in mouse Mϕ, the role in human Mϕ was analyzed. First, it was determined by human SLAMF8 overexpression experiments in the THP-1 cell line that the effect of SLAMF8 on the regulation of NOX2 activation in human monocytes was similar to that observed in mouse Mϕ. Second, given the plasticity of functions associated with Mϕ, SLAMF8 expression was analyzed in human Mϕ M1 and M2 subtypes. The results showed that SLAMF8 was expressed in both Mϕ subtypes, possibly indicative of a possible involvement of SLAMF8 in the modulation of pro- and anti-inflammatory responses. In summary, this study performs an in-depth analysis of the role of SLAMF8 in Mϕ functionality. Thanks to the set of results obtained, it is confirmed that SLAMF8 is able to negatively regulate activation processes in vitro, through its negative regulating action on PI3K in the PKC and PI3K feedback loop. Furthermore, our results indicate that SLAMF8 is capable of negatively modulating microbicidal mechanisms both in vitro and in vivo, and that its function in human may be similar to that found in mouse. This raises the possibility of its use as a therapeutic target through its intervention for the treatment of severe or unresolved inflammatory states.

En primer lugar, se realizó un estudio sobre la activación de NOX2 a través de vías directas e indirectas de PKC en Mϕ de ratones deficientes para SLAMF8 (SLAMF8-/-) en comparación con Mϕ de la cepa salvaje (WT, wild type o SLAMF8+/+). Para este estudio las células fueron estimuladas con PMA y LPS puro, y empleamos inhibidores específicos para las vías de activación mediadas por PKC, p38 MAPK y PI3K. Los resultados confirmaron que en ausencia de SLAMF8 la activación de NOX2 a través de PCK estaba incrementada en las subunidades p47phox y p40phox, detectando también una mayor activación de p38 y ERK1/2 MAPK. El estudio con inhibidores confirmó estos resultados, y además no solo mostró la modulación negativa de NOX2 por SLAMF8 a través de estas vías, sino que la inhibición específica de PI3K igualaba la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, Reactive Oxygen Species) entre las muestras. Es más, con el inhibidor de la PI3K las diferencias observadas en las vías de activación de NOX2 desaparecían, igualando el nivel de activación entre Mϕ SLAMF8-/- y WT. Además, el análisis sobre la movilización de las subunidades citosólicas de NOX2 y la reorganización del citoesqueleto de actina, nos mostró que SLAMF8 también regula negativamente estos procesos probablemente a través de su acción sobre la PI3K. Debido a que los resultados indicaron que SLAMF8 actuaba regulando negativamente procesos implicados en la eliminación de microorganismos, se analizó el efecto que podría tener este receptor en la progresión de infecciones graves. Para esto, empleamos un modelo infeccioso por Salmonella typhimurium in vitro. Los resultados mostraron que SLAMF8 era capaz de regular negativamente los mecanismos microbicidas NOX2 e iNOS y sus vías de activación en Mϕ, confirmando de nuevo por el empleo de inhibidores que, la ausencia de SLAMF8 afecta a la vía de activación sobre estos mecanismos por la PI3K. En este estudio además observamos que SLAMF8 afectaba al proceso de modulación que ejerce S. typhimurium sobre la activación de NOX2 e iNOS en el SCV (Salmonella-containing vacuole), analizando la activación de las enzimas a diferentes tiempos de maduración del SCV: temprano, intermedio y tardío. Con objeto de confirmar la modificación en la composición del SCV en sus diferentes estadios de maduración, analizamos el reclutamiento de Rab5, Rab7 y p47phox hacia el SCV mediante microscopia láser confocal. De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluyó que la ausencia de SLAMF8 generaba una mayor fusión de fagosomas con lisosomas y una progresión alterada del SCV, lo que probablemente generaba un detrimento de S. typhimurium en el control de la progresión del SCV, fundamental para el mantenimiento y proliferación de la bacteria. Todo esto nos lleva a concluir que SLAMF8 es capaz de modular negativamente la activación de mecanismos microbicidas a través de su acción sobre la PI3K. Creemos que la intervención modula negativamente el bucle de retroalimentación de la PKC y PI3K, ya que la inhibición de PI3K elimina completamente las diferencias observadas entre los Mϕ SLAMF8-/- y WT, estimulados tanto con bacteria como con agonistas de la PKC o LPS puro. Esto concuerda con el hecho de que los Mϕ SLAMF8-/- presenten una mayor polarización y migración, mecanismo que está controlado también mediante el bucle de retroalimentación PKC-PI3K. Teniendo en cuenta que algunos de los receptores de la familia del SLAM pueden modular la activación en Mϕ por medio de su asociación con los receptores tipo Toll (TLRs), se analizó la expresión de TLRs implicados en la eliminación de Salmonella. Los resultados mostraron un ligero aumento significativamente mayor en la expresión de tlr2 y tlr4 en ausencia de SLAMF8. No creemos que esta pequeña diferencia sea causante del fenotipo observado, aunque también podría contribuir a ello. También analizamos la expresión de Slamf9, miembro de la familia implicado en la eliminación de este microorganismo, ya que se ha descrito una acción conjunta de éste con SLAMF8 en un modelo de sepsis con LPS, mediante la modulación de la expresión de TLR4. No encontramos diferencias en la expresión de Slamf9 en el modelo de infección con S. typhimurium in vitro. En cambio, sí se observó que, en ausencia de SLAMF8 estaba incrementada la expresión de la citoquina il-6 bajo este modelo de infección, lo que indicaba que, efectivamente SLAMF8 modula la respuesta inflamatoria en Mϕ y por tanto su acción es efectiva durante procesos infecciosos. A continuación, se analizó el papel de SLAMF8 sobre la vía de activación Src quinasa y la fosfatasa SHP-1, por su implicación en procesos de activación de NOX2 e intervención en la activación de mecanismos para la eliminación de microorganismos. Los resultados mostraron una mayor activación de Src quinasas y un detrimento en la activación de la fosfatasa SHP-1 en ausencia de SLAMF8, bajo el modelo de infección con S. typhimurium in vitro. Se observó que el tratamiento con IFNγ en los Mϕ SLAMF8-/- ya incrementa la activación de Src y, además, que bajo el estímulo de S. typhimurium incrementaba aún más la activación de Src quinasas acompañado de un detrimento en SHP-1. Creemos que esto es debido al incremento en la producción de ROS, descrito como activador de Src e inhibidor de SHP1. Todo esto nos lleva a concluir que SLAMF8 también modula el cebado o inicio de activación de los Mϕ, ya que observamos que el tratamiento con LPS o IFNγ ya muestra diferencias en la activación de los mismos. La función de SLAMF8 sobre la activación de los mecanismos microbicidas NOX2 e iNOS y de sus vías de activación en Mϕ de ratón, fueron confirmados por medio de experimentos de sobreexpresión de SLAMF8 murino en la línea celular RAW264.7, en los que se obtuvo un fenotipo contrario al observado en Mϕ deficientes en SLAMF8. Posteriormente, la confirmación de que SLAMF8 presentaba un papel sobre la regulación de los mecanismos microbicidas, se obtuvo por medio del estudio de SLAMF8 sobre la capacidad microbicidad de S. typhimurium in vivo. Los resultados indicaron que ratones deficientes en SLAMF8 presentaban una mayor capacidad microbicida que los WT, y que en ausencia de SLAMF8 hay una reducción de la capacidad proliferativa de S. typhimurium. Estos resultados probablemente sean producidos por la mayor inducción de iNOS y NOX2 detectada en los ratones SLAMF8-/- que, en consecuencia, generarían una menor acidificación del fagosoma ya observada en los Mϕ SLAMF8-/-, que impediría la acidificación acelerada del SCV, efecto utilizado por la bacteria para su replicación. Finalmente dada su función en Mϕ de ratón, se analizó su posible papel en Mϕ humanos. En primer lugar, se determinó por medio de experimentos de sobreexpresión de SLAMF8 humano en la línea celular THP-1, que el efecto de SLAMF8 sobre la regulación de la activación de NOX2 en monocitos humanos era similar al observado en Mϕ de ratón. En segundo lugar, dada la plasticidad de funciones asociada a los Mϕ, se analizó la expresión de SLAMF8 en los subtipos de Mϕ M1 y M2 en humano. Los resultados mostraron que SLAMF8 se expresaba en ambos subtipos de Mϕ, lo que posiblemente era indicativo de una posible implicación de SLAMF8 en la modulación de respuestas pro- y anti-inflamatorias. En resumen, este estudio hace un análisis en profundidad del papel de SLAMF8 en la funcionalidad de los Mϕ. Gracias al conjunto de resultados obtenidos, se confirma que SLAMF8 es capaz de regular negativamente procesos de activación in vitro, y que lo hace a través de su acción moduladora negativa sobre la PI3K en el bucle de retroalimentación de la PKC y PI3K. Además, nuestros resultados indican que SLAMF8 es capaz de modular negativamente mecanismos microbicidas tanto in vitro como in vivo, y que su función en humano puede ser similar a la encontrada en ratón. Esto plantea la posibilidad de su uso como diana terapéutica a través de su intervención para el tratamiento de estados inflamatorios severos o no resueltos.